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螺旋藻藻蓝蛋白抗百草枯诱导大鼠肺纤维化的研究

作　者: 孙英新
导　师: 秦松
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物学
关键词: 藻蓝蛋白 钝顶螺旋藻 百草枯（PQ） 肺纤维化 细胞转化生长因子-β1 核因子-κB 肿瘤坏死因子-α
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


海洋是药物的宝库，近年来，随着海洋生物学研究的不断深入，发现许多海洋藻类含有多种特有的天然的药用活性物质。藻蓝蛋白(Phycocyanin, PC)主要存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数一些甲藻中，是藻胆蛋白的重要组分，在螺旋藻中的含量较高。研究表明，PC具有抗炎症、抗氧化、清除自由基、抗肿瘤等生理活性，为螺旋藻在保健和药用领域的开发提供重要的依据。百草枯（Paraquat, PQ），是目前世界范围内应用最广泛的除草剂之一。随着在我国农业上的广泛应用，PQ中毒也日趋增多。PQ对人畜均有较强毒性，致死剂量小，发展快且无特效解毒药物，临床上病死率很高。肺为PQ中毒的主要靶器官，大剂量中毒常由于急性肺损伤所致的呼吸衰竭及心、肝、肾等多脏器功能衰竭而死亡；较小剂量的中毒往往引起迟发性的肺纤维化，病程相对较长，晚期多死于肺间质纤维化所致的呼吸衰竭。传统的糖皮质激素和细胞毒药物长期应用副作用大，疗效并不理想。因此寻找行之有效的治疗药物是目前医疗界迫切需要解决的问题。PQ的中毒是多系统、多器官、多水平的，中毒机制尚未完全阐明，但多数学者认为，其中毒机制在于氧化损伤。PC能有效地清除氧基自由基，有较强抗氧化能力，对小鼠或大鼠炎症模型具有明显的抑制作用。这些活性作用对PQ中毒有潜在的治疗效果。目前，海洋药物尚未用于中毒治疗学研究，本课题研究的主要目的旨在研究PC对抗急性PQ中毒引起的急性肺损伤和肺纤维化作用，以期为临床救治和探索海洋药物治疗急性中毒提供科学依据。本研究首先对钝顶螺旋藻中的PC进行了提取和纯化。采用磷酸盐缓冲液循环冻融联合超生波破碎法，50%硫酸铵沉淀获得PC，提取率达到13.2%。粗蛋白提取液再经过两次羟基磷灰石柱(HA)层析和sephacrylS-200HR凝胶层析对其进行纯化，纯度比（A620/A280）达到4.75。然后我们对PC抗PQ诱导肺纤维化进行了研究：（1）肺组织病理变化：①苏木精伊红染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)：模型（PQ）组1-7d以急性肺泡炎为主要表现，3d时炎症表现最重，14-28d成纤维细胞增生，大量肺泡结构萎陷、破坏，胶原沉积，肺纤维化初步形成。PC组各观察点病理变化和模型组相似，但程度较轻。早期（3、7d）即肺泡炎期，肺泡渗出、细胞浸润少，中后期（14、28d）即肺纤维化进展和纤维化期，在胶原沉积，肺纤维化进展程度轻。②马松三色（Masson）染色：28d时模型组可见较多蓝色胶原沉积于支气管壁及肺泡间隔，蓝染面积百分比较对照组有显著性差异（P<0.01）。PC组蓝染胶原沉积较少，蓝染面积百分比较PQ组差异有显著性（P<0.05）。③电镜：PQ组：早期可见肺泡I型上皮细胞受损，纤毛脱失，基膜断裂，肺泡腔内有大量水肿渗出液，多见巨噬细胞，间质炎性细胞浸润；后期可见到肺泡间隔增厚，内含大量增生、肥大的肺泡n型上皮细胞，板层小体空泡化，多见异型核，肺泡隔内弹性纤维、胶原纤维和网状纤维多，胶原纤维增生明显。PC治疗后PQ中毒大鼠肺组织超微结构表现为肺泡炎及纤维增生减轻。（2）血清和肺组织均浆丙二醛（MDA）含量变化：染毒后，染毒大鼠血清和肺组织均浆MDA含量均明显升高（P<0.01），PC治疗后，各观察点PC组MDA含量升高程度明显低于PQ组（P<0.01）。（3）肺组织中羟脯氨酸（HYP）含量变化：染毒后，染毒大鼠肺组织均浆HYP含量均明显升高（P<0.01），PC治疗后，各观察点PC组HYP含量升高程度明显低于PQ组（P<0.01）。（4）血清中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力变化：染毒后，染毒大鼠血清中GSH-Px活力均明显降低（P<0.01），PC治疗后，各观察点PC组GSH-Px活力明显高于PQ组（P<0.01）。（5）血清和肺组织均浆超氧化物歧化酶（SOD）活力变化：染毒后，染毒大鼠血清和肺组织中SOD活力均明显降低（P<0.01），PC治疗后，各观察点PC组SOD活力升高，与PQ组相比差异显著（P<0.01）。（6）肺组织均浆细胞转化生长因子-β1（TGF-β1）的蛋白水平变化：染毒后，染毒大鼠肺组织中TGF-β1的蛋白水平均明显升高（P<0.01），PC治疗后，各观察点PC组TGF-β1的蛋白水平降低，与PQ组相比差异显著（P<0.01）。（7）肺组织肿瘤坏死因子-α （TNF-α）、核因子-κB（NF-κB）的影响：染毒后，染毒大鼠肺组织中TNF-α的含量均明显升高(P<0.01)，3d时肺组织中TNF-α的含量最高，其后逐渐降低，28d时肺组织中TNF-α的含量最低。各观察时间点，PC组大鼠肺组织中TNF-α的含量均低于染毒组（P<0.01）。NF-κBp65的结果与TNF-α相似，7d时肺组织中NK-κBp65的含量最高，其后逐渐下降。各观察时间点，PC组大鼠肺组织中NK-κBp65的含量均低于染毒组（P<0.01）。结果表明：PC可以提高肺组织SOD和血浆GSH-Px、SOD活性，降低肺组织HYP、MDA和血浆MDA含量，降低肺纤维化大鼠肺组织TGF-β1的蛋白水平，抑制NF-κB亚基p65及TNF-α活性，减轻PQ中毒大鼠肺泡炎及后期纤维化程度，对PQ诱导的大鼠肺泡炎及肺纤维化具有显著的抑制作用，对PQ中毒有较好的治疗效果。该研究将为海洋药物治疗PQ中毒致肺纤维化提供新的思路。

全文目录


摘要  4-7
ABSTRACT  7-11
目录  11-13
第一章 引言  13-51
  第一节 螺旋藻研究  13-20
    1 螺旋藻的基础研究  14-17
    2 螺旋藻的应用研究  17-20
  第二节 螺旋藻藻蓝蛋白的研究  20-51
    1 藻胆体  20-21
    2 藻胆蛋白  21-29
    3 PC 的提取和纯化  29-31
    4 PC 理化性质  31-34
    5 藻胆蛋白基因工程  34-39
    6 藻胆蛋白的表达和调控  39-42
    7 藻胆蛋白的生物学活性  42-47
    8 藻胆蛋白的应用及开发  47-51
第二章 百草枯中毒研究进展  51-67
  1 中毒机制  51-54
  2 病理变化  54-55
  3 病理生理  55-56
  4 临床表现  56-57
  5 诊断和中毒程度分级  57-58
  6 治疗  58-65
  7 PQ 中毒预后判断  65-66
  8 展望  66-67
第三章 钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的提取和纯化  67-82
  材料和方法  67-73
    1 材料  67-70
    2 方法  70-73
  结果  73-78
    1 PC 浓度测定  73
    2 PC 提取率的影响因素  73-75
    3 纯化结果  75-78
  讨论  78-82
    1 PC 的分离纯化  78-80
    2 影响因素  80-82
第四章 藻蓝蛋白抗 PQ 诱导大鼠肺纤维化作用的实验研究  82-117
  材料和方法  83-90
    1 实验材料  83-86
    2 实验方法和步骤  86-90
    3 统计学分析  90
  结果  90-105
    1 大鼠行为变化  90
    2 大鼠体重变化  90-91
    3 大鼠肺组织病理学表现  91-100
    4 病理肺泡炎及肺纤维化量化分级  100-101
    5 肺组织中 HYP、MDA 含量及 SOD 的活性变化及干预效果  101-102
    6 血清中 GSH-Px、SOD 活力和 MDA 的含量变化及干预效果  102-104
    7 大鼠肺组织均浆 TGF-β1含量测定  104-105
  讨论  105-117
    1 PQ 诱导肺纤维化大鼠模型的复制  106
    2 PQ 致肺纤维化机制  106-109
    3 PC 对 PQ 中毒大鼠中毒症状及肺系数变化的影响  109
    4 PC 对 PQ 中毒诱导大鼠肺纤维化模型肺组织形态学的影响  109-110
    5 PC 对 PQ 中毒诱导大鼠肺纤维化肺组织 HYP 含量的影响  110-111
    6 PC 对 PQ 中毒诱导大鼠肺纤维化肺组织均浆及血清 SOD 含量的影响  111-113
    7 PC 对 PQ 中毒诱导大鼠肺纤维化血清 GSH-Px 活性的影响  113-114
    8 PC 对 PQ 中毒诱导大鼠肺纤维化血清和肺组织 MDA 含量的影响  114-115
    9 PC 对 PQ 中毒诱导大鼠肺纤维化肺组织转化生长因子-β1含量的影响  115-117
第五章 藻蓝蛋白对 PQ 诱导大鼠肺纤维化肺组织 TNF-α、NF-κ B 的影响  117-140
  材料与方法  118-124
    1 材料  118-119
    2 实验方法  119-123
    3 统计分析  123-124
  结果  124-132
    1 Western-blot 实验结果  124-129
    2 免疫组化实验结果  129-132
  讨论  132-140
    1 PC 对 PQ 中毒诱导肺纤维化大鼠肺组织 TNF-α的影响  133-135
    2 PC 对 PQ 中毒诱导肺纤维化大鼠肺组织 NF-κ Bp65 的影响  135-140
参考文献  140-162
发表及已完成文章目录  162-163
致谢  163

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学 > 中药实验药理
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