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各类复杂基质中蓖麻毒素的定性及定量检测方法的研究

作　者: 马小溪
导　师: 谢剑炜
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药物分析学
关键词: 蓖麻毒素酶联免疫分析液相色谱串联质谱多反应监测免疫磁珠
分类号: R284.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

蓖麻毒素蛋白是从大戟科植物蓖麻籽(Ricinu communis)中分离出来的一种II型核糖体失活蛋白,相对分子量约为66 kDa,由A、B两条肽链通过二硫键连接而成,其中A链为效应链,具有失活核糖体的能力,抑制蛋白质合成,从而引起细胞死亡;B链含有两个半乳糖残基结合位点,能与细胞上含半乳糖残基的糖蛋白或糖脂结合,从而介导毒素进入细胞发挥毒性。由于蓖麻毒素毒性极高、来源广泛、易于提取并且没有特效解毒药,因此已被人们视为一种极有可能被用作恐怖袭击或制造极端事件的生物毒素。对于这一潜在的生物战剂,快速、灵敏的检测方法是预防中毒发生和中毒后医学救治的重要研究手段。目前,最常见的蓖麻毒素检测方法大都是基于抗体的免疫学分析方法。由于免疫分析法能够实现对靶分子灵敏、快速的定性、定量分析,因此,该方法非常适合于污染或中毒样品中蓖麻毒素的鉴定与含量测定。然而,免疫分析法的特异性时常受到挑战,检测过程中容易与其他分子结构相似的蛋白发生交叉反应而造成假阳性结果,例如蓖麻毒素与蓖麻毒素凝集素(RCA120)。RCA120含有两条A链和两条B链,其肽序列与蓖麻毒素相比相似度高达85%以上,然而其毒性却远低于蓖麻毒素。由于RCA120与蓖麻毒素极为相似,所以做到准确区分两种蛋白十分困难。目前,绝大多数检测蓖麻毒素的免疫学方法都无法特异性地区分这两种蛋白,因此我们需要联合应用两种或两种以上的检测技术,实现对蓖麻毒素的准确鉴定。自上世纪90年代中期开始,越来越多的现代先进分析仪器被用于分析鉴定蓖麻毒素。随着生物质谱技术的快速发展,现在已经将其用于一系列生物分子的高灵敏、高准确度的检测,并能实现对分子结构的剖析。因此包括电喷雾电离或基质辅助激光解吸等电离方式的质谱检测技术已被越来越广泛地用于分析生物环境中的蛋白质的种类并对其进行绝对定量。本论文的研究内容是建立酶联免疫分析法和液相色谱-质谱检测分析法对不同基质中的蓖麻毒素进行定性、定量检测。论文由三个部分组成。第一章概述了蓖麻毒素的物理和化学性质,并且总结了蓖麻毒素的各种中毒途径及中毒症状以及近几年来蓖麻毒素检测方法的发展现状。最后则归纳了研究论文的意义、内容与创新点。第二章主要研究建立了三种酶联免疫定量分析法,即光吸收、荧光和化学发光免疫分析法对不同基质中蓖麻毒素的定量检测,在适宜检测条件下,对各方法进行了系统的方法学考察,包括标准曲线的线性范围、灵敏度、精密度及特异性等方面。结果表明,化学发光酶联免疫分析法线性范围较宽(0.02-5.5μg/L, R为0.999)、灵敏度最高(检测限为0.005μg/L)、简单、快速、稳定性强,是三种策略中的最优途径。另外,我们将三种方法应用于饮用水、饮料和人血清中添加的蓖麻毒素的检测,其回收率与精密度均符合定量标准要求。第三章中我们建立了液相色谱-质谱检测方法对蓖麻毒素进行定性及定量检测。首先,我们通过LC-Q-TOF/MS提供的质谱数据检索到14条与蓖麻毒素匹配的肽段,并从中选取三条质谱响应信号强、特异性好的酶解肽段用于蓖麻毒素的定性及定量分析。随后,通过质谱多反应监测技术(MRM),建立了一种快速、准确、高特异性的缓冲液中蓖麻毒素的定量方法。继而,为了能够实现复杂样品及临床样品中蓖麻毒素的高灵敏检测,本论文进一步利用免疫亲和磁珠作为有效前处理方法,从而排除基质中杂蛋白的干扰并能够实现对蓖麻毒素的富集。我们将前处理过程与质谱检测技术进行有效结合,可以实现对人血清中添加的蓖麻毒素的高灵敏检测,其最低检测限为1.25 ng/mL。最后我们将此方法成功用于染毒大鼠血清中蓖麻毒素残留量的定量测定。结果表明,8小时内的大鼠血清中蓖麻毒素残留量均能检出,8小时的毒素残留量约为10 ng/mL。

全文目录

缩略词表  7-9
摘要  9-11
Abstract  11-14
第一章前言  14-24
  1.1 蓖麻毒素种类与性质  14
  1.2 蓖麻毒素分子结构  14-15
  1.3 蓖麻毒素毒性及中毒机理  15
  1.4 蓖麻毒素的分离纯化  15-16
  1.5 蓖麻毒素中毒途径及症状  16-17
    1.5.1 食入  16-17
    1.5.2 吸入  17
    1.5.3 皮肤及眼部暴露  17
    1.5.4 注射  17
  1.6 蓖麻毒素中毒后的治疗  17-18
  1.7 蓖麻毒素的应用  18-19
    1.7.1 肿瘤治疗  18
    1.7.2 生物农药  18-19
  1.8 蓖麻毒素的检测方法  19-22
    1.8.1 免疫分析法  19-21
    1.8.2 仪器分析法  21-22
  1.9 本论文的研究意义、内容与创新点  22-24
第二章酶联免疫分析法定量分析蓖麻毒素  24-44
  2.1 引言  24-25
  2.2 实验部分  25-31
    2.2.1 实验材料  25-27
      2.2.1.1 仪器  25
      2.2.1.2 材料与主要试剂  25-26
      2.2.1.3 溶液配制  26-27
    2.2.2 蓖麻毒素的纯化与鉴定  27-28
      2.2.2.1 蓖麻毒素的制备  27-28
      2.2.2.2 蓖麻毒素的纯度考察  28
      2.2.2.3 蓖麻毒素的鉴定  28
    2.2.3 光吸收-酶联免疫分析法测定蓖麻毒素  28-29
    2.2.4 荧光-酶联免疫分析法测定蓖麻毒素  29
    2.2.5 化学发光-酶联免疫分析法测定蓖麻毒素  29-30
    2.2.6 三种酶联免疫分析法测定蓖麻毒素的精密度及特异性考察  30
    2.2.7 实际样品中蓖麻毒素的测定  30
    2.2.8 CLIA法对染毒大鼠血清中残留蓖麻毒素的定量检测  30-31
  2.3 结果与讨论  31-43
    2.3.1 蓖麻毒素的纯化与鉴定结果  31-34
      2.3.1.1 蓖麻毒素纯化结果  31-32
      2.3.1.2 蓖麻毒素鉴定结果  32-34
    2.3.2 酶联免疫分析方法检测蓖麻毒素条件优化  34-36
    2.3.3 光吸收-酶联免疫分析法测定蓖麻毒素  36-37
      2.3.3.1 标准曲线及检出限的测定  36
      2.3.3.2 方法精密度和重现性的考察  36-37
      2.3.3.3 实际样品中蓖麻毒素的测定  37
    2.3.4 荧光-酶联免疫分析法测定蓖麻毒素  37-39
      2.3.4.1 标准曲线及检出限的测定  37-38
      2.3.4.2 精密度和重现性的考察  38-39
      2.3.4.3 实际样品中蓖麻毒素的测定  39
    2.3.5 化学发光-酶联免疫分析法测定蓖麻毒素  39-41
      2.3.5.1 标准曲线及检出限的测定  40
      2.3.5.2 精密度和重现性的考察  40-41
      2.3.5.3 实际样品中蓖麻毒素的测定  41
    2.3.6 CLIA法对染毒大鼠血清中残留蓖麻毒素的定量检测  41-42
    2.3.7 CLIA在第一届蓖麻毒素国际实验室间比对测试中的应用  42-43
  2.4 本章小结  43-44
第三章液相色谱-质谱联用技术定量分析蓖麻毒素  44-72
  3.1 引言  44-45
  3.2 实验部分  45-53
    3.2.1 实验材料  45-46
      3.2.1.1 实验用材料及主要试剂  45
      3.2.1.2 实验用设备  45-46
    3.2.2 免疫磁珠的制备  46
      3.2.2.1 生物素标记抗蓖麻毒素单克隆抗体3D74  46
      3.2.2.2 链霉亲和素修饰磁珠与生物素标记抗体的反应  46
      3.2.2.3 免疫磁珠捕获蓖麻毒素载量计算  46
    3.2.3 蓖麻毒素特异性肽段挑选  46-48
      3.2.3.1 毒素蛋白的胰酶酶切  46-47
      3.2.3.2 液相色谱分离条件  47
      3.2.3.3 四级杆-飞行时间串联质谱条件  47
      3.2.3.4 Spectrum Mill 搜索引擎参数条件  47-48
    3.2.4 蓖麻毒素特异性肽段定量检测条件优化  48-49
      3.2.4.1 液相色谱分离条件  48-49
      3.2.4.2 三重串联四级杆质谱条件  49
      3.2.4.3 定性及定量肽段离子对选择及参数优化  49
    3.2.5 缓冲液中蓖麻毒素定量检测方法学考察  49-50
      3.2.5.1 检出限、定量限及标准曲线测定  49-50
      3.2.5.2 方法精密度和回收率测定  50
      3.2.5.3 样品稳定性测试  50
    3.2.6 免疫磁珠对缓冲液中蓖麻毒素的富集与检测  50-52
      3.2.6.1 洗脱条件的优化  50
      3.2.6.2 检出限、定量限及标准曲线测定  50-51
      3.2.6.3 方法精密度和回收率测定  51-52
    3.2.7 免疫磁珠对人血清中蓖麻毒素的富集与检测  52
      3.2.7.1 检出限、定量限及工作曲线测定  52
      3.2.7.2 方法精密度和回收率测定  52
    3.2.8 免疫磁珠对大鼠血清中蓖麻毒素的富集与检测  52-53
      3.2.8.1 检出限、定量限及工作曲线测定  52
      3.2.8.2 方法精密度和回收率测定  52-53
    3.2.9 染毒大鼠血清中蓖麻毒素残留量的检测  53
  3.3 结果与讨论  53-70
    3.3.1 链霉亲和素磁珠结合抗体量的计算  53-54
    3.3.2 免疫磁珠捕获蓖麻毒素结合量测定  54-55
    3.3.3 蓖麻毒素特异性肽段挑选  55-58
    3.3.4 定性及定量离子对选择及参数优化  58-60
    3.3.5 缓冲液中蓖麻毒素定量检测方法学考察  60-62
      3.3.5.1 标准曲线、线性范围及最低检测限、最低定量限  60-61
      3.3.5.2 方法精密度和回收率测定  61-62
      3.3.5.3 样品稳定性考察  62
    3.3.6 基于免疫磁珠富集的缓冲液中蓖麻毒素的检测  62-66
      3.3.6.1 洗脱液对蓖麻毒素检测影响  62-64
      3.3.6.2 检出限、定量限及标准曲线测定  64-65
      3.3.6.3 方法精密度和回收率测定  65-66
    3.3.7 基于免疫磁珠富集的人血清中蓖麻毒素的检测  66-68
      3.3.7.1 检出限、定量限及工作曲线测定  66-67
      3.3.7.2 方法精密度和回收率测定  67-68
    3.3.8 基于免疫磁珠富集的大鼠血清中蓖麻毒素的检测  68-69
      3.3.8.1 检出限、定量限及工作曲线测定  68-69
      3.3.8.2 方法精密度和回收率测定  69
    3.3.9 染毒大鼠血清中残留蓖麻毒素的定量检测  69-70
  3.4 本章小结  70-72
结论  72-74
参考文献  74-80
附录：攻读学位期间发表文章目录  80-81
文献综述  81-93
  参考文献  89-93
发表论文  93-98
个人简历  98-99
致谢  99-100

各类复杂基质中蓖麻毒素的定性及定量检测方法的研究

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