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大鲵虹彩病毒灭活方法比较与疫苗制备技术研究

作　者: 孙建滨
导　师: 曾令兵
学　校: 华中农业大学
专　业: 水产养殖
关键词: 大鲵虹彩病毒 β-丙内酯福尔马林灭活疫苗制备
分类号: S947.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

大鲵(Chinese giant salamander, Andrias davidianus),俗名“娃娃鱼”,是我国珍贵的保护动物与新兴养殖品种。鉴于大鲵极高的经济价值,近几年在陕西、湖南、浙江、湖北等省大鲵人工繁育和集约化养殖发展十分迅速。但是,随着大鲵养殖范围与规模的不断扩大,以及养殖集约化程度的不断提高,养殖大鲵的病害问题日趋严重,严重阻碍了大鲵养殖产业的健康发展。大鲵病毒性出血病是危害养殖大鲵最严重的疾病,其病原为大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus, GSIV)。疫苗免疫被认为是预防水生动物疾病最为有效的方法,其中,灭活疫苗的应用最为普遍与安全。本文研究了p-丙内酯(β-propiolactone, BPL)和福尔马林两种灭活剂灭活GSIV的方法,比较了两种灭活剂的灭活条件与效果,确定了GSIV细胞培养灭活疫苗的制备方法,为大鲵虹彩病毒病免疫预防技术研究与应用奠定了重要前期基础。研究内容和结果如下：1. GSIV BPL灭活方法的研究。选用终浓度分别为0.025%、0.05%、0.1%、0.2%的BPL灭活细胞培养的GSIV,4℃条件下分别灭活处理24h、48h、72h,96h,采用细菌培养、细胞培养、病毒核酸PCR扩增以及鱼体感染试验进行灭活病毒的安全性检验,确定了最适灭活条件。采用病毒结构蛋白SDS-PAGE电泳与Western blotting试验比较研究了最适灭活条件下灭活病毒结构蛋白与抗原性变化情况。试验结果表明,GSIV经终浓度为0.1%的BPL4℃灭活处理72h后可完全灭活病毒,灭活病毒无细菌污染,接种对GSIV敏感的鲤上皮瘤细胞系(EPC)细胞无细胞病变效应(CPE)出现,病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因特异性引物PCR反应未扩增出靶基因产物,灭活病毒对健康大鲵的感染试验未出现疾病症状。终浓度为0.1%的BPL于4℃条件灭活GSIV72h,其结构蛋白SDS-PAGE电泳与Western blotting试验结果表明,与未灭活GSIV相比较,灭活GSIV的结构蛋白与抗原性未发生显著变化。2. GSIV福尔马林灭活方法的研究。选用终浓度分别为0.05%,0.1%,0.2%,0.4%福尔马林灭活细胞培养的GSIV,旋涡混匀后置于37℃培养箱中,分别在灭活24h、48h、72h、96h后采用细菌培养、细胞培养、病毒核酸PCR扩增以及鱼体感染试验进行灭活病毒的安全性检验,确定其最适灭活条件。采用病毒结构蛋白SDS-PAGE电泳与Western blotting试验比较分析了最适灭活条件下灭活病毒结构蛋白与抗原性变化情况。试验结果表明,GSIV经终浓度为0.2%的福尔马林37℃灭活处理72h后可完全灭活病毒,灭活病毒无细菌污染,接种EPC细胞无CPE出现,病毒MCP基因特异性引物PCR反应未扩增出靶基因产物,灭活病毒对健康大鲵的感染试验未出现疾病症状。经最适条件灭活的GSIV,其结构蛋白SDS-PAGE电泳与Western blotting试验结果表明,与未灭活GSIV相比较,灭活GSIV的结构蛋白有较明显破坏,但保持了一定的抗原性。3.大鲵虹彩病毒灭活疫苗免疫效果初步研究。血清中和抗体效价检测结果显示两种灭活疫苗免疫大鲵后均可得到较高的抗体水平,且在免疫后21d抗体效价最高,但BPL灭活疫苗组抗体水平整体优于福尔马林组。相对免疫保护率结果可看出,注射BPL灭活疫苗的实验组获得了更好的免疫保护效果。两种灭活疫苗的免疫效果研究表明,BPL在疫苗的制备过程对病毒抗原的破坏作用小于福尔马林,从而使疫苗保持了更好的免疫原性。

全文目录

摘要  9-11
Abstract  11-13
缩略语表  13-14
第一章文献综述  14-27
  1.1 中国大鲵  14-16
    1.1.1 大鲵资源  14
    1.1.2 中国大鲵的生物学特性  14
    1.1.3 中国大鲵的价值  14-15
    1.1.4 中国大鲵的地理分布  15
    1.1.5 中国大鲵的养殖现状  15-16
  1.2 大鲵病害的研究进展  16-20
    1.2.1 大鲵细菌性疾病  16-18
      1.2.1.1 大鲵赤皮病  17
      1.2.1.2 大鲵腹水病  17
      1.2.1.3 大鲵细菌性败血症  17
      1.2.1.4 大鲵腐皮病  17-18
      1.2.1.5 大鲵肠炎病  18
    1.2.2 大鲵真菌性疾病  18
    1.2.3 大鲵寄生虫疾病  18-19
      1.2.3.1 吸虫病  18-19
      1.2.3.2 线虫病  19
    1.2.4 大鲵非寄生性疾病  19
    1.2.5 大鲵病毒性疾病  19
    1.2.6 大鲵疾病的防治  19-20
  1.3 大鲵病毒性出血病研究进展  20-24
    1.3.1 临床症状与流行病学研究  20
    1.3.2 大鲵虹彩病毒的生物学研究  20-21
    1.3.3 大鲵虹彩病毒的检测与诊断技术  21-24
      1.3.3.1 电镜技术  22
      1.3.3.2 细胞培养技术  22
      1.3.3.3 PCR技术  22-23
      1.3.3.4 免疫学技术  23-24
  1.4 疫苗的灭活方法研究  24-26
    1.4.1 物理灭活  24
    1.4.2 化学灭活  24-26
      1.4.2.1 福尔马林  24-25
      1.4.2.2 烷化剂  25
      1.4.2.3 β-丙内酯  25
      1.4.2.4 苯酚  25-26
      1.4.2.5 结晶紫  26
  1.5 研究目的及意义  26-27
第二章大鲵虹彩病毒β-丙内酯灭活方法的研究  27-40
  2.1 材料与方法  27-32
    2.1.1 试验材料  27-28
    2.1.2 试验试剂与器皿  28-29
      2.1.2.1 试验试剂  28-29
      2.1.2.2 试验器皿  29
    2.1.3 引物设计  29
    2.1.4 试验仪器与设备  29-30
    2.1.5 病毒培养及滴度测定  30-31
      2.1.5.1 病毒培养  30
      2.1.5.2 病毒滴度测定  30-31
    2.1.6 病毒灭活  31
      2.1.6.1 BPL灭活时间的确定  31
      2.1.6.2 BPL灭活浓度的确定  31
    2.1.7 安全性检验  31-32
      2.1.7.1 无菌检验  31
      2.1.7.2 细胞感染试验  31
      2.1.7.3 鱼体感染试验  31-32
    2.1.8 灭活效果检测  32
      2.1.8.1 PCR核酸检测  32
      2.1.8.2 灭活GSIV结构蛋白SDS-PAGE分析  32
      2.1.8.3 灭活GSIV抗原蛋白Western Blot分析  32
  2.2 结果与分析  32-38
    2.2.1 病毒培养及滴度测定  32-33
    2.2.2 无菌检验结果  33
    2.2.3 BPL最适灭活时间  33-34
    2.2.4 BPL最适灭活浓度  34
    2.2.5 鱼体感染试验  34-35
    2.2.6 病毒核酸PCR检测  35-36
    2.2.7 灭活GSIV结构蛋白SDS-PAGE分析  36-37
    2.2.8 Western Blotting抗原性分析  37-38
  2.3 讨论  38-39
  2.4 结论  39-40
第三章大鲵虹彩病毒福尔马林灭活方法的研究  40-49
  3.1 材料与方法  40-43
    3.1.1 试验材料  40
    3.1.2 试验试剂与器皿  40-41
      3.1.2.1 试验试剂  40-41
      3.1.2.2 试验器皿  41
    3.1.3 引物设计  41
    3.1.4 试验仪器与设备  41-42
    3.1.5 病毒灭活  42
    3.1.6 安全性检验  42
      3.1.6.1 无菌检验  42
      3.1.6.2 细胞感染试验  42
      3.1.6.3 鱼体感染试验  42
    3.1.7 灭活效果检测  42-43
      3.1.7.1 PCR核酸检测  42-43
      3.1.7.2 灭活GSIV结构蛋白SDS-PAGE分析  43
      3.1.7.3 灭活GSIV抗原蛋白Western Blot分析  43
  3.2 结果与分析  43-47
    3.2.1 无菌检验结果  43
    3.2.2 福尔马林最适灭活条件  43-44
    3.2.3 鱼体感染试验  44-45
    3.2.4 病毒核酸PCR检测  45
    3.2.5 灭活GSIV结构蛋白SDS-PAGE分析  45-46
    3.2.6 Western Blotting抗原性分析  46-47
  3.3 讨论  47-48
    3.3.1 福尔马林灭活机制  47
    3.3.2 灭活效果和安全性检测  47
    3.3.3 灭活疫苗的应用  47-48
  3.4 结论  48-49
第四章大鲵虹彩病毒灭活疫苗免疫效果初步研究  49-55
  4.1 材料与方法  49-51
    4.1.1 试验材料  49
    4.1.2 试验试剂与器皿  49
      4.1.2.1 试验试剂  49
      4.1.2.2 试验器皿  49
    4.1.3 试验仪器与设备  49-50
    4.1.4 病毒的灭活  50
    4.1.5 安全性检验  50-51
      4.1.5.1 无菌检验  50
      4.1.5.2 细胞感染试验  50-51
    4.1.6 免疫效果分析  51
      4.1.6.1 血清中和抗体效价检测  51
      4.1.6.2 相对免疫保护力检测  51
  4.2 结果与分析  51-52
    4.2.1 安全性试验  51-52
    4.2.2 血清中和抗体效价检测  52
    4.2.3 相对免疫保护力测定  52
  4.3 讨论  52-53
  4.4 结论  53-55
参考文献  55-63
附录  63-64
致谢  64-65

大鲵虹彩病毒灭活方法比较与疫苗制备技术研究

内容摘要

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