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新腹足目贝类DNA条形码系统构建及系统发育研究

作　者: 邹山梅
导　师: 李琪
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: DNA条形码 物种鉴定 系统发育 新腹足目 骨螺科 织纹螺属
分类号: S917.4
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


新腹足目隶属于腹足纲，种类繁多，其中包含约16000种海洋肉食性种类，为深海环境中一群主导性无脊椎动物类群，对海洋生态环境起着重要的调节作用。经过长期的形态演变之后，捕食行为成为新腹足目最显著的生物特征。新腹足目贝类包含大量重要的经济种类，如骨螺科、织纹螺科、塔螺科和滨螺科等经济贝类。这些经济种类都具有极其丰富的生物多样性。贝壳外部特征和消化系统解剖结构为新腹足目贝类重要的分类特征。然而，由于外部环境的影响，这些分类特征具有极大的形态可塑性，且某些群体种内差异性较大而种间差异性较小。这都使得利用传统形态特征对新腹足目贝类进行物种鉴定和系统发育分析变得极其困难，从而导致新腹足目贝类的分类处于混乱状态。利用DNA序列进行物种多样性分析成为一种有效的研究途径。最新提出的DNA条形码（DNAbarcoding）技术，即利用一段短的DNA序列作为物种快速鉴定的标记，并希望以此建立DNA序列和生物物种之间一一对应的关系，已成功应用于动物、植物及微生物界。DNA条形码作为对地球上现有物种进行识别和鉴定的一项新技术，受到国内外广泛关注。本研究利用DNA条形码技术和相关分子标记对新腹足目贝类，特别是一些经济种类，如骨螺科和织纹螺科贝类，进行了全面的物种鉴定和系统发育研究，并验证了DNA条形码及其分析方法的有效性。研究结果如下：1.骨螺科DNA条形码与系统发育研究本研究中，我们运用DNA条形码技术对中国沿海17个分类比较混乱的骨螺科种类进行了物种鉴定分析。COI、16SrDNA、ITS-1和28SrRNA四个基因位点被应用于120个个体的条形码和系统发育分析。首先，由于部分骨螺个体不能用COI和16S rDNA通用引物成功扩增，我们设计出骨螺科COI和16SrDNA特异性扩增引物。研究结果显示COI基因能够成功区分所有研究种类，可以作为骨螺科理想的条形码标记基因。16SrDNA、ITS-1和28SrRNA也能够成功区分大部分研究种类，但是不能清楚鉴定一些近缘物种。另外，基于单基因数据集和整合数据集的分析结果显示爱尔螺亚科、红螺亚科、刍秣螺亚科和骨螺亚科均形成单系群，尤其是红螺亚科独自形成一单系群。本研究利用多基因位点并结合形态学特征对骨螺科种类，特别是一些经济种类，进行了有效的物种鉴定，对骨螺科种类的生态学、群体学、养殖学等研究提供了有力的分类依据。2.织纹螺属（Nassarius）贝类隐存多样性研究本研究对中国沿海22个织纹螺属种类的220个个体进行了全面的DNA条形码分析。其中，我们从中国沿海采集到208个织纹螺个体，并对其进行COI和16S rDNA序列的扩增与测序，其他个体序列从Genbank下载获得。距离法、单系法和特征法条形码分析方法在本研究中得到成功的应用。但是相比距离法和单系法，特征法更具优越性。研究结果表明COI和16S rDNA邻接树及贝叶斯树都显示织纹螺属为单系群体。结合线粒体序列、核基因序列及形态特征，我们成功鉴定出13个织纹螺种类，并揭示出4个隐存种和一对同物异名种类。如此成功的物种鉴定及隐存种发现对于织纹螺属的食品安全问题和多样性保护具有重大的意义，并提醒我们要更加关注被忽略的海洋隐存多样性现象。3.新腹足目贝类分子系统发育研究本研究首次在国内外运用多基因位点相结合（部分CO1、16S、12S、H3部分序列和18S全序列）对大量的新腹足目样本（13个科）和外群体（15个科）进行了全面的系统发育分析。运用最大简约法、最大似然法和贝叶斯方法对所得序列进行了进化树的构建。研究结果表明新腹足目为一个单系群体，其同形态学研究结果相一致，验证了运用相关形态学特征对新腹足目进行系统发育分析的有效性，并推翻了过去分子研究中新腹足目为并系或多系群体的观点。过去的分子研究由于运用有限的基因位点和分析样本而缺乏说服力。本研究结果还显示鹑螺总科和琵琶螺总科形成一个单系，并作为新腹足目的姐妹群。这一结果支持了新腹足目起源于高层中腹足目的假设。新腹足目内各个科之间的关系也在本研究中得到了厘清。除了滨螺科、塔螺科和细带螺科为并系或多系群体外，其他所有科均显示为单系群。本研究首次对新腹足目这一大海洋生物类群的进化地位进行了系统而全新的定位。4. DNA条形码分析方法的比较研究为了检测三种DNA条形码分析方法的有效性，即单系法、距离法和特征法（Distance,monophyly, and character–based barcoding methods），我们分别从科、属、种分类水平对40个新腹足目贝类物种的COI和16S rDNA序列进行了条形码分析。研究结果显示：（1）距离分析法不能有效的区分大部分种类，特别对于一些近缘种类，种内和种间遗传距离出现明显的重叠区，没有理想的条形码间隙（barcodinggap）出现；（2）COI邻接树比16SrDNA邻接树可以更有效的区分所研究种类，但不能有效区分一些近缘种类；（3）对于COI和16S rDNA基因，特征分析法均可以正确鉴定所有研究的新腹足目种类，并且可以有效区分一些属。此研究证明DNA条形码特征分析方法可以对不同水平的物种分类单元进行有效的区分和鉴定，特别是对于近缘物种。其次，相比距离法和单系法，特征法DNA条形码可以运用相对保守的基因片段进行条形码分析，更具优越性。

全文目录


摘要  5-8
Abstract  8-16
第一章 文献综述  16-37
  1 DNA 条形码  17-23
    1.1 DNA 条形码的概念、原理  17-18
    1.2 DNA 条形码的优越性  18-19
    1.3 DNA 条形码的分析流程  19
    1.4 DNA 条形码的分析方法  19-20
    1.5 DNA 条形码在海洋生物中的应用  20-22
    1.6 基于 DNA 条形码和传统分类学的整合物种鉴定  22-23
  2 分子系统发育学  23-26
    2.1 系统发育学的发展  23
    2.2 分子系统发育学的概念  23-24
    2.3 分子系统发育学的分析方法  24-26
  3 新腹足目贝类概况  26-28
    3.1 新腹足目贝类的形态特征  26-27
    3.2 新腹足目贝类的生活习性  27-28
    3.3 新腹足目贝类的地理分布  28
    3.4 新腹足目系统发育  28
  4 骨螺科贝类概况  28-34
    4.1 外部形态特征  29
    4.2 生活习性与地理分布  29
    4.3 形态学物种鉴定  29-31
    4.4 基于形态学和分子方法的系统发育研究  31-34
  5 织纹螺属贝类概况  34-35
    5.1 外部形态特征  34
    5.2 生活习性与地理分布  34
    5.3 形态学物种鉴定  34-35
    5.4 织纹螺属贝类食品安全问题  35
  6 本研究的立题依据、研究内容及其目的意义  35-37
    6.1 立题依据  35-36
    6.2 研究内容及其目的意义  36-37
第二章 骨螺科贝类DNA 条形码与系统发育研究  37-57
  0 引言  37-38
  1 材料与方法  38-46
    1.1 样品采集与鉴定  38
    1.2 DNA 提取、PCR 扩增与测序  38-44
    1.3 数据分析  44-46
  2 结果  46-54
    2.1 基于 DNA 条形码的物种鉴定  46-47
      2.1.1 COI 条形码分析  46
      2.1.2 16S rDNA 条形码分析  46-47
      2.1.3 核基因条形码分析  47
      2.1.4 红螺属物种鉴定  47
    2.2 骨螺科内亚科间的系统发育关系  47-54
  3 讨论  54-56
    3.1 骨螺科贝类 COI 特异性引物  54
    3.2 线粒体和核基因条形码的功能比较  54-55
    3.3 骨螺科内亚科间的进化关系  55-56
  4 结论  56-57
第三章 织纹螺属贝类隐存多样性研究  57-78
  0 引言  57-59
  1 材料与方法  59-60
    1.1 样品采集与鉴定  59
    1.2 DNA 提取，PCR 扩增与测序  59
    1.3 距离法和单系法条形码分析  59-60
    1.4 特征法条形码分析  60
  2 结果  60-74
    2.1 基于单系法、距离法和特征法的 COI 条形码构建  65
    2.2 基于单系法和特征法的 16S rDNA 条形码构建  65-66
    2.3 基于单系法和特征法的 ITS-1 条形码构建  66-74
  3 讨论  74-78
    3.1 织纹螺属隐存多样性  74-75
    3.2 DNA 条形码物种鉴定  75-78
第四章 新腹足目贝类分子系统发育研究  78-100
  0 引言  78-80
  1 材料与方法  80-90
    1.1 样品的采集  80
    1.2 DNA 提取、PCR 扩增与 DNA 测序  80
    1.3 序列编辑、整合与分析  80-88
    1.4 系统发生树的构建  88-90
      1.4.1 模型选择  89
      1.4.2 贝叶斯系统发育树的构建  89
      1.4.3 最大简约法系统发育树的构建  89-90
      1.4.4 最大似然法系统发育树的构建  90
  2 结果  90-92
    2.1 序列长度与特征  90
    2.2 单基因数据集的系统发育分析  90
    2.3 基于整合数据集的新进腹足总目系统发育分析  90-91
    2.4 基于整合数据集的新腹足目系统发育分析  91-92
  3 讨论  92-99
    3.1 基于多基因位点和大量样本分析的新进腹足总目的系统发育  92-97
    3.2 多基因位点和大量样本对新腹足目贝类系统发育研究的影响  97-98
    3.3 基于整合数据集的新腹足目系统发育分析  98-99
  4 结论  99-100
第五章 DNA 条形码分析方法的比较研究  100-119
  0 引言  100-101
  1 材料与方法  101-105
    1.1 样品采集  101-102
    1.2 DNA 提取，PCR 扩增与测序  102
    1.3 距离法和单系法条形码分析  102-104
    1.4 特征法条形码分析  104-105
  2 结果  105-116
    2.1 基于距离法的条形码分析结果  105-107
    2.2 单系法分析结果  107-108
    2.3 特征法分析结果  108-116
      2.3.1 种水平  108
      2.3.2 属水平  108-116
  3 讨论  116-118
    3.1 单系法和距离法 DNA 条形码物种鉴定  116-117
    3.2 特征法分析  117-118
  4 结论  118-119
参考文献  119-133
致谢  133-134
攻读学位期间已发表的学术成果  134-135

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