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昭通天麻DNA条形码研究及药用成分分析

作　者: 唐科民
导　师: 钱子刚
学　校: 云南中医学院
专　业: 中药学
关键词: 天麻变型 DNA条形码 HPLC
分类号: R284.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

天麻（Gastrodia elata Bl.）隶属于兰科（Orchidaceae）、兰亚科（Subfam.Orchidoideae）、树兰族（Trib. Epidendreae）、天麻亚族（Subtrib. Gastrodiinae）天麻属（Gastrodia R.Br.）腐生草本植物，无根无绿叶，与蜜环菌（Armillaria mellea(Vahl ex Fr.) Karst.）共生。天麻以块茎入药，是主产于我国的名贵中药，在我国已有两千余年的用药历史。《中国植物志》记载天麻属在我国分布有13种，昭通地区所分布的主要为天麻（G. elata Bl.）的4个变型，即红天麻（G. elata Bl. f.elata）、绿天麻（G. elata Bl. f. viridis Makino）、乌天麻（G. elata Bl. f. glaucaS.Chow）、黄天麻（G. elata Bl. f. flavida S. Chow）。本文综合应用了形态学、DNA条形码技术和化学成分分析等手段和方法对昭通天麻黄、绿、乌3个变型的分类进行了研究。此外，我们也对昭通天麻不同变型共生真菌的种类进行了探讨，主要研究结果如下：1.天麻的形态分类研究昭通天麻植物形态特征差异明显，从株高、花色、茎秆颜色以及块茎表型性状可直观对天麻3个变型——乌天麻、黄天麻、绿天麻进行形态分类。3个变型天麻块茎表型性状具有一定程度的多样性。乌天麻个体较大，与黄天麻和绿天麻差异明显，且乌天麻遗传变异稳定，可作为栽培天麻的优质种源。天麻块茎各表型性状变型间变异大于变型内变异，从这个意义上来说，变型间变异是天麻的主要变异来源；天麻药材由于经过加工炮制，3个变型之间的药材形态特征已经很接近，形态鉴别困难。2.昭通天麻的DNA条形码研究分析比较了ITS、matK、rbcL、trnH-psbA、trnL-F五个DNA条形码候选序列在天麻不同变型内和变型间的鉴别效果，并对组合片段ITS+rbcL的鉴定效果进行了评估。在天麻ITS、rbcL、matK和trnH-psbA基因中，仅ITS和rbcL得到扩增，但变型内变型间没有明显的barcoding gap，上述通用条码不适合作为昭通天麻种下变型DNA条形码的研究，但是ITS序列可作为不同居群天麻的分子鉴别研究；叶绿体基因片段rbcL和trnH-psbA的成功扩增，推测天麻叶绿体仍未退化完全。从ITS序列分析得出，黄天麻与乌天麻亲缘关系最近，其次是绿天麻与黄天麻，乌天麻与绿天麻亲缘关系最远；天麻ITS序列在变型内和变型间大部分个体变异较小，仅有少部分个体变异较大，变异主要发生在ITS1区；就变型内来说，绿天麻的遗传变异最大，乌天麻和黄天麻遗传变异较小，乌天麻和黄天麻遗传稳定，有利于天麻的遗传育种。昭通天麻与贵州大方天麻的亲缘关系较近，而与陕西汉中天麻的亲缘关系却相对较远，不同来源相同变型天麻的ITS序列差异明显，而相同来源不同变型间的ITS序列同源性较高。天麻共生菌不是单一的蜜环菌（Armillaria mellea (Vahl ex Fr.) Karst.），大部分是蜜环菌属（Armillaria spp.）的其他种，各蜜环菌种与各变型天麻的共生并非一一对应关系。天麻共生菌可能还含有小菇属（Mycena）真菌，但是未发现有小菇属真菌紫萁小菇（Myeena osmundieola Lange）存在。3.昭通天麻药用成分研究经HPLC检测，各变型天麻天麻素含量：干品乌天麻>鲜品红天麻>鲜品黄天麻>鲜品绿天麻>鲜品乌天麻；对羟基苯甲醇含量：鲜品绿天麻>鲜品红天麻>鲜品黄天麻>鲜品乌天麻>干品乌天麻；腺苷含量：鲜品红天麻>干品乌天麻>鲜品黄天麻>鲜品乌天麻>鲜品绿天麻；对羟基苯甲醛含量：干品乌天麻>鲜品乌天麻>鲜品绿天麻>鲜品黄天麻>鲜品红天麻。鲜品天麻的天麻素含量均低于干品天麻，药用天麻以炮制加工后的成品麻为佳。不同变型天麻中天麻素、对羟基苯甲醇、腺苷和对羟基苯甲醛含量均有一定差异，但暂未发现其变化的规律性。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-11
英文缩略词表  11-12
引言  12-14
第一章天麻的分类研究  14-28
  1. 天麻植物的分类学简史  14-20
    1.1 天麻的本草考证  14
    1.2 我国天麻属植物的分类学研究  14-17
    1.3 天麻属植物形态特征  17-18
    1.4 天麻及其种下变型的分类概述  18-20
  2. 昭通天麻的来源组成及特征  20-22
  3. 昭通天麻 3 个变型块茎的表型性状分析  22-26
    3.1 实验材料  22
    3.2 实验方法  22-23
    3.3 统计结果与分析  23-26
  4. 小结与讨论  26-28
第二章昭通天麻 DNA 条形码研究  28-61
  1. 材料与方法  28-37
    1.1 实验材料  28-29
    1.2 主要仪器  29-30
    1.3 主要试剂  30
    1.4 主要溶液配制  30-31
    1.5 实验方法  31-36
    1.6 数据处理  36-37
  2. 结果与分析  37-57
    2.1 改良 CTAB 法提取天麻不同部位 DNA  37-39
    2.2 天麻药材总 DNA 提取  39
    2.3 PCR 扩增效率及测序成功率  39-46
    2.4 数据分析  46-57
  3. 小结与讨论  57-61
第三章昭通天麻药用成分分析  61-77
  1. 仪器与试药  61-62
    1.1 仪器  61
    1.2 试药  61-62
  2. 方法与结果  62-74
    2.1 天麻素和对羟基苯甲醇的含量测定  62-68
    2.2 腺苷和对羟基苯甲醛的含量测定  68-74
  3. 小结与讨论  74-77
第四章结论  77-79
第五章文献综述  79-92
  1. 植物 DNA 条形码的研究概况  79-84
    1.1 DNA 条形码技术的概念  79-80
    1.2 植物 DNA 条形码候补片段的研究  80-83
    1.3 DNA 条形码技术鉴定流程  83-84
  2. 兰科植物 DNA 条形码的研究  84
  3. 天麻属的研究背景  84-92
    3.1 天麻的本草考证  84-85
    3.2 天麻种质资源研究  85-88
    3.3 天麻不同变型的分类鉴定及亲缘关系研究  88
    3.4 天麻共生菌研究  88-90
    3.5 天麻的化学成分研究  90-92
参考文献  92-98
附录  98-106
致谢  106

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