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DHAV-1感染性克隆构建及其部分生物学活性研究

作　者: 陈君豪
导　师: 姜世金
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: DHAV-1 全长cDNA 拯救病毒感染性克隆生物学活性研究
分类号: S858.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

A型鸭病毒性肝炎(Type A Duck viral hepatitis)是由鸭甲肝病毒(duck hepatitis A virus,DHAV)感染导致的急性和高度致死性传染病，主要感染1～3周龄雏鸭，死亡率高达90%以上，该病有3个血清型，即DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3，3个型有着明显的差异，交叉免疫性差。其中DHAV-1型鸭病毒性肝炎呈世界性分布，是严重危害养鸭业的主要疫病之一。本研究构建了DHAV-1LY0802株的传染性克隆，并对其部分生物学特性进行了研究。1、DHAV-1LY0802株的传染性克隆的构建及病毒拯救参照GenBank上公布的序列设计9对引物，通过RT-PCR的方法获得从鸭群中分离到的DHAV-1LY0802株的忠实cDNA。其中采用RACE方法分别对5’端和3’端未知序列进行测定。测序结果与GenBank公布的序列比较后发现，同源性高达93.2%～95.2%。参考载体pCDNA3.1与病毒序列中酶切位点的位置，设计5对引物，将DHAV全基因组分为5个片段定向装配到载体上。通过引物设计的方法，在cDNA的5’端添加sp6启动子和3’端添加亲本病毒序列中不存在的酶切位点Xho后，按照顺序将其装配到pCDNA3.1载体上。通过点突变的方法优化序列最前端的AUG环境，并以此作为遗传标记以区别母本病毒与拯救病毒。按照既定顺序将LY0802株全长cDNA按顺序连接到pCDNA3.1载体上获得阳性重组子pLYDHAV，序列测定后发现有7位碱基发生突变，其中第13、19位碱基为人工诱变，用于优化AUG环境和作为遗传标记。变异碱基造成第5、7位氨基酸序列发生突变，其余突变均为无义突变。用XhoⅠ酶切重组质粒pLYDHAV进行体外转录后立即用于转染BHK-21细胞，并以母本RNA作阳性对照，以无菌PBS作为阴性对照。转染后BHK-21细胞出现明显的CPE，且用RT-PCR方法和IFA方法检测均为阳性结果。经过遗传标记的鉴定，表明造成细胞病变的是拯救病毒而非感染野毒。2、拯救病毒的部分生物学特性研究分别在转染后24、36、48、60、72h收集拯救病毒粒子。用此拯救病毒和母本病毒分别感染BHK-21细胞，测定各时段病毒的TCID50，并绘制病毒的生长曲线。生长曲线表明在转染60h后病毒复制量达到顶峰，且拯救病毒与母本病毒的生长曲线特征相似。为了研究拯救病毒的感染性，将30只1日龄的健康小鸭子分成三个组。其中1组和2组分别皮下注射0.25ml（104TCID50）的拯救病毒和母本病毒（104.2TCID50），对照组皮下注射相同剂量的无菌pH7.4的PBS。结果显示拯救病毒感染性与母本病毒相似，感染鸭临床特征明显。LY0802株DHAV-1的感染性克隆的成功构建为下一步深入开展DHAV-1的致病机理的研究奠定了重要的基础。

全文目录

符号说明  4-9
中文摘要  9-11
Abstract  11-13
1 前言  13-27
  1.1 鸭甲肝病毒（DHAV）概述  13
  1.2 DHAV-1 的病毒学分类  13-14
  1.3 DHAV-1 的形态学结构和理化特性  14
    1.3.1 形态学结构  14
    1.3.2 理化特性  14
    1.3.3 DHAV-1 的病原性  14
  1.4 DHAV-1 流行病学  14-15
  1.5 病毒的培养增殖  15
  1.6 DHAV-1 的分子生物学研究  15-19
    1.6.1 病毒基因组及主要结构和功能蛋白的特性  15-17
    1.6.2 DHAV-1 感染机制  17-18
    1.6.3 鸭病毒性肝炎（DVH）的诊断方法  18-19
  1.7 DHAV-1 的预防与治疗  19-20
    1.7.1 DHAV-1 的预防  19-20
    1.7.2 治疗  20
  1.8 RNA 病毒感染性克隆操作技术研究进展  20-26
    1.8.1 感染性克隆的构建基础  21-25
    1.8.2 感染性克隆的应用  25-26
  1.9 本研究的目的及意义  26-27
2 材料与方法  27-47
  2.1 材料  27-30
    2.1.1 菌（毒）株  27
    2.1.2 实验动物及细胞株  27
    2.1.3 酶和相关试剂  27
    2.1.4 主要仪器  27
    2.1.5 引物设计与合成  27-29
    2.1.6 溶液系统  29-30
  2.2 方法  30-47
    2.2.1 病毒的分离与鉴定  30-32
      2.2.1.1 病毒的分离  30
      2.2.1.2 病毒 RNA 的提取  30-31
      2.2.1.3 病毒 RT-PCR 检测  31-32
      2.2.1.4 电泳检测  32
    2.2.2 病毒的增殖与纯化  32
    2.2.3 DHAV-1 LY0802 株病毒全基因组序列测定  32-35
      2.2.3.1 病毒 RNA 的提取  32
      2.2.3.2 病毒基因组 RT-PCR 扩增  32
      2.2.3.3 电泳检测  32
      2.2.3.4 PCR 产物的回收  32-33
      2.2.3.5 DNA 与载体的连接  33
      2.2.3.6 DH5α大肠杆菌感受态细胞的制备  33
      2.2.3.7 连接产物的转化  33-34
      2.2.3.8 质粒 DNA 的提取  34-35
      2.2.3.9 重组质粒 PCR 鉴定  35
    2.2.4 感染性克隆的构建  35-42
      2.2.4.1 各个片段的融合 PCR 扩增  35-38
      2.2.4.2 全长 cDNA 的构建  38-41
      2.2.4.3 序列分析  41-42
    2.2.5 DHAV-1 感染性克隆拯救病毒粒子的获得与鉴定  42-44
      2.2.5.1 pLYDHAV 重组质粒的提取  42
      2.2.5.2 重组质粒的线性化  42
      2.2.5.3 体外转录物 RNA 的制备  42-43
      2.2.5.4 DHAV-1 病毒的拯救  43
      2.2.5.5 拯救病毒的鉴定  43-44
        2.2.5.5.1 BHK-21 细胞的病变效应（CPE）  43-44
        2.2.5.5.2 RT-PCR 扩增目的片段  44
        2.2.5.5.3 间接免疫荧光（IFA）检测病毒抗原的表达  44
    2.2.6 拯救病毒的部分生物学指标的分析  44-47
      2.2.6.1 拯救病毒与母本病毒生长曲线的绘制  44-46
        2.2.6.1.1 BHK-21 细胞的培养  44-45
        2.2.6.1.2 接种拯救病毒与母本病毒  45
        2.2.6.1.3 拯救病毒与母本病毒 TCID50 的测定  45
        2.2.6.1.4 生长曲线的绘制  45-46
      2.2.6.2 拯救病毒与母本病毒毒力的测定  46-47
3 结果与分析  47-57
  3.1 病毒的分离鉴定结果  47-48
    3.1.1 接种鸭胚结果  47
    3.1.2 RT-PCR 鉴定结果  47-48
  3.2 全基因组序列测定结果  48
    3.2.1 目的片段 PCR 检测  48
    3.2.2 全基因组序列拼接和分析  48
  3.3 感染性克隆的构建结果  48-52
    3.3.1 全长 cDNA 构建结果  48-49
    3.3.2 重组质粒序列分析结果  49-50
    3.3.3 拯救病毒的鉴定  50
    3.3.4 间接免疫荧光（IFA）检测结果  50-51
    3.3.5 拯救病毒的 RT-PCR 鉴定  51-52
  3.4 病毒生长曲线的绘制结果和分析  52-55
  3.5 拯救病毒与母本病毒毒力的测定结果  55-57
4 讨论  57-62
  4.1 DHAV-1 全基因组克隆测序  57-58
  4.2 感染性克隆的构建  58-59
  4.3 拯救病毒的鉴定  59-60
  4.4 拯救病毒与母本病毒 TCID50的检测  60-61
  4.5 拯救病毒与母本病毒毒力的测定  61-62
5 结论  62-63
6 参考文献  63-69
7 致谢  69-70
8 攻读学位期间发表论文情况  70

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