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藏鸡腿肌全长cDNA文库构建与其ESTs的生物信息学分析和验证

作　者: 李长春
导　师: 李奎；刘榜
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 藏鸡 腿肌全长cDNA文库 生物信息学分析 新基因 M-ASP SNPs 生长性状 关联分析
分类号: S831
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
下　载: 659次
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内容摘要


主要分布于青藏高原的藏鸡,是我国在原始饲养状态下保存下来的珍贵家禽品种。它有耐寒、抗病、抗缺氧、肉质鲜美、药用价值较高,耐粗放和可观赏性强等的优点,同时也有生长速度慢,产蛋率低的缺点。如何利用藏鸡的优点而改良藏鸡的缺点,如何从藏鸡的遗传本质上利用和改良藏鸡就显得很有实际的价值和意义。 针对藏鸡的主要缺点,改良藏鸡的任务的一个主要方面就是提高藏鸡的生长速度。首先,就要克隆和鉴定一批可能与藏鸡生长相关的基因,然后对这些基因的功能进行研究,进而应用于藏鸡的生产实践。本研究利用生物信息学与分子生物学技术相结合的方法,克隆和鉴定了一批可能与藏鸡生长相关的新基因,取得了如下结果: 1.利用SMARTTM（Switching Mechanism At 5’ end of RNA Transcript）cDNA文库构建试剂盒(SMARTTM cDNA Library Construction Kit)构建了藏鸡腿肌全长cDNA文库。文库质量鉴定的结果表明,文库滴度为1.1×106,重组率为99%,平均插入片段长度为1.2-1.5kb之间。文库插入基因的完整比率为47.36%。 2.对藏鸡腿肌全长cDNA文库的插入片段进行了5’端随机测序,获得了200条ESTs序列。利用DNAStar软件中的SeqMan程序对这200条ESTs序列组装后形成了80条Contigs或者Singletons。全长cDNA标注的结果表明它们都不包含完整的基因。 3.对涉及13个新基因的22条ESTs序列所对应的克隆子进行了重新测序并测通。经过组装和全长cDNA鉴定,最终发现对应于Serf1基因和假蛋白基因的ESTs序列可能包含了完整基因序列,其序列长度分别为713bp和2408bp;对应于未知基因、Myotilin、Glypican 4和Cytochrome c oxidase, subunit Vic基因的4条ESTs序列可能包含了基因的完整编码区（Coding Sequence, CDS）序列。其长度分别为462bp、1268bp、568bp和496bp。 4.对44条新ESTs序列进行了电子延伸,其中40条得到了有效延长。这40条超级片段重叠群序列（Super Contigs, SC序列,实际还是ESTs序列）的全长cDNA鉴定结果表明,可能包含完整基因的SC序列共10条,而可能含有完整CDS的SC序列共有9条。 5.对经全长cDNA鉴定为可能包含完整基因的12条ESTs的核酸序列进行了基本性质、电子表达谱、电子基因定位、编码区的翻译蛋白质的基本性质、结构和功能等分析;对可能包含完整CDS的9条ESTs只进行了编码区的翻译蛋白质序列的基本性质、结构和功能等分析。分析结果表明,这21条ESTs序列都或多或少含有一些重要的功能位点和功能结构域。 6.对对应于Serf1和eIF3S9基因的两条ESTs序列进行了5’和3’RACE验证,获得了长度分别为702bp和884bp的序列。与原来的ESTs序列同源性比对,分别延

全文目录


中文摘要  11-13
ABSTRACT  13-16
一、文献综述  16-42
  1． 藏鸡的特点和研究现状  16-19
  2． 鸡基因组计划和基因图谱  19-23
  3． 新基因的克隆方法  23-24
  4． 鸡腿肌全长cDNA文库的构建及其 ESTs测序  24-28
    4．1 组织和文库的选择  24-25
    4．2 cDNA文库的构建方法和种类  25-27
    4．3 文库质量鉴定和ESTs随机测序  27-28
  5． 表达序列标签(ESTs)及其应用概况  28-31
    5．1 EST概念和特点  29-30
    5．2 ESTs的应用  30-31
  6． 生物信息学研究内容与分析方法  31-33
  7． 几个候选基因的研究现状  33-38
    7．1 GH基因的研究现状  34-35
    7．2 IGF-I基因的研究现状  35-36
    7．3 Ghrelin基因的研究现状  36
    7．4 两个新基因 Serf1和eIF3S9的研究现状  36-38
      7．4．1 eIF3S9基因  36-37
      7．4．2 Serf1基因  37-38
  8． 遗传标记与 SNP检测方法  38-42
    8．1 遗传标记  38-40
    8．2 SNP检测方法  40-42
二、本研究的目的和意义  42-44
三、材料与方法  44-70
  1． 材料  44-49
    1．1 组织样品  44-45
    1．2 DNA样品  45-47
    1．3 主要试剂及配制  47-48
      1．3．1 主要试剂和试剂盒  47
      1．3．2 实验载体和菌株  47
      1．3．3 主要试剂的配制  47-48
    1．4 主要仪器设备  48
    1．5 主要分子生物学与生物信息学软件  48-49
  2． 方法  49-70
    2．1 藏鸡腿肌全长cDNA文库的构建方法  49-54
      2．1．1 总 RNA提取  51
      2．1．2 mRNA纯化  51
      2．1．3 cDNA合成、酶切及分级分离  51-54
        2．1．3．1 cDNA第一链合成  51-52
        2．1．3．2 LD PCR扩增cDNA  52
        2．1．3．3 酶切  52-53
        2．1．3．4 cDNA的分级分离  53-54
      2．1．4 cDNA与pBluescript Ⅱ SK~*载体连接、重组质粒的转化  54
    2．2 藏鸡腿肌全长cDNA文库的 ESTs序列的生物信息学分析  54-57
    2．3 对感兴趣的未知基因的 ESTs所对应的克隆子重测序与分析  57
    2．4 RACE技术和克隆新基因全长及分析  57-60
      2．4．1 RACE技术  57-58
      2．4．2 应用 RACE技术获得新基因(eIF3S9和 Serf1)全长  58-59
      2．4．3 新基因(EIF3S9和 Serf1)片段的生物信息学分析  59
      2．4．4 RACE-PCR产物的纯化、克隆、鉴定与测序  59-60
    2．5 几个候选基因的 SNP检测方法  60-62
      2．5．1 PCR-RFLP  60
      2．5．2 改良 ASP  60-62
    2．6 鸡中几个候选基因的 SNP检测  62-68
      2．6．1 IGF-I基因  62-63
      2．6．2 GH基因  63-64
      2．6．3 Ghrelin基因  64-67
      2．6．4 新基因eIF3S6和 Serf1  67-68
    2．7 候选基因与鸡生长性状的关联分析  68-70
四、结果  70-133
  1． 藏鸡腿肌全长cDNA文库的构建与质量鉴定  70-73
    1．1 藏鸡腿肌全长cDNA文库的构建  70-72
      1．1．1 腿肌组织总 RNA提取与质量检测  70-71
      1．1．2 m RNA的分离和纯化  71
      1．1．3 cDNA第一链和第二链的合成、酶切与分级分离  71-72
    1．2 文库质量鉴定  72-73
  2． 文库插入片段的5’端随机测序及其初步分析  73-75
    2．1 cDNA的5’端随机测序  73
    2．2 ESTs序列的初步分析  73-75
  3． ESTs的生物信息学分析与鉴定  75-113
    3．1 ESTs序列的同源性比对  75-87
    3．2 新 ESTs序列的全长标注  87-92
    3．3 新 ESTs序列对应克隆子的重新测序和序列分析  92-96
    3．4 不包含完整基因的 ESTs序列的电子延伸  96-98
    3．5 电子延伸的 ESTs序列的全长鉴定与分析  98-102
    3．6 包含完整基因或CDS的ESTs序列分析  102-113
      3．6．1 核酸序列的生物信息学分析  103-106
      3．6．2 蛋白质序列的生物信息学分析  106-113
  4． 两条 EST序列的RACE结果  113-114
  5． 几个基因的 SNP检测及其与鸡生长性状关联分析  114-133
    5．1 GH基因内含子4的SNP及其与鸡生长性状的关联分析  114-117
      5．1．1 PCR扩增结果和酶切结果及基因型分布  114-116
      5．1．2 总体效应分析  116
      5．1．3 品种间基因型效应分析  116-117
      5．1．4 品种内基因型效应分析  117
    5．2 IGF-I基因5’UTR的SNP及其与鸡生长性状的关联分析  117-122
      5．2．1 PCR扩增和酶切结果  117-118
      5．2．2 基因型频率和单倍型频率  118-119
      5．2．3 两品种之间基因型和单倍型组合频率的x~2检验结果  119-120
      5．2．4 总体效应分析  120
      5．2．5 两品种间基因型效应分析  120-121
      5．2．6 品种内基因型效应分析  121-122
    5．3 Ghrelin基因 SNP及其与鸡生长性状关联分析  122-128
      5．3．1 同源性比对分析  122
      5．3．2 SNP检测结果  122-124
      5．3．3 三个位点基因型频率、基因频率、单倍型频率与单倍型组合频率  124-126
      5．3．4 品种和基因型或单倍型组合与鸡生长性状之间的关联分析  126-128
      5．3．5 藏鸡生长相关的 M-ASP多态性标记快速检测试剂盒的构建  128
    5．4 eIF3S9基因和 Seif1基因 SNP及其与鸡生长性状关联分析  128-133
      5．4．1 eIF3S9基因SNP及其与鸡生长性状关联分析  128-131
      5．4．2 Serf1基因SNP及其与鸡生长性状关联分析  131-133
五、讨论  133-142
  1． 关于藏鸡腿肌的取样、RNA提取和全长cDNA文库构建  133-134
  2． 关于 EST的生物信息学分析以及新基因的克隆与鉴定  134-136
  3． 关于利用 EST序列查找 SNPs的方法  136-137
  4． 关于改良ASP技术与多态性检测方法  137-138
  5． 关于引物设计的想法  138-139
  6． 关于基因与鸡生长性状的关联分析  139-142
六、小结  142-144
参考文献  144-160
在读期间发表论文题录、申请发明专利和参编专著  160-162
致谢  162-163

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家禽 > 鸡
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