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绵羊肺炎支原体多表位疫苗的研究及免疫试验

作　者: 张轩
导　师: 逯忠新
学　校: 中国农业科学院
专　业: 兽医
关键词: 绵羊肺炎支原体 EF-Tu PDHA 热休克蛋白70 多表位疫苗免疫效果评价
分类号: S858.26
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，Mo）是引起绵羊和山羊传染性肺炎的病原,主要危害１～３月龄的羔羊。该病原引起的疾病发生于世界多个国家，是影响养羊业发展的主要传染病之一。免疫预防是控制动物传染病的有效手段，因此研究有效的绵羊支原体肺炎疫苗是预防控制本病的有效措施。本论文着眼于近些年发展起来的多表位疫苗技术，结合本实验室前期研究基础，通过鉴定绵羊肺炎支原体免疫原性蛋白的T细胞表位和B细胞表位，并对多个表位进行串联表达和免疫实验，进行了绵羊支原体肺炎多表位疫苗的初步研究。本论文首先对绵羊肺炎支原体的EF-Tu基因进行了适当优化、合成并进行了原核表达，对获得的43kD的重组蛋白进行了Western-blot检测和动物免疫实验，结果表明该蛋白可与Mo GH3-3株全菌高免羊血清之间发生特异性反应，在43-55kD之间出现了特异性的反应条带，并且能诱导小鼠产生抗体，间接ELISA方法检测为阳性，证明具有较好的免疫原性。然后利用生物信息学软件对EF-Tu和本实验室之前已经验证过具有免疫原性的PDHA蛋白进行了抗原表位预测，对合成的表位肽进行了实验验证，成功选取了较好的4个B细胞表位和2个T细胞表位，同时再加上已经证明具有免疫增强剂作用的热休克蛋白（Hsp）70蛋白C端序列，通过柔性氨基酸接头分子串联以后应用生物信息学软件对串联体进行了抗原性比较，最后选取了一个预测得分最高的串联体进行了合成、原核表达和免疫原性研究。结果表明，该串联表位重组蛋白的表达量很高（达到0.49mg/mL菌液），用Mo GH3-3株全菌高免羊血清做Western-blot检测发现在目的蛋白条带（34kD左右）处出现了特异性反应条带。免疫小鼠以后，能诱导机体产生血清抗体，分离脾细胞用该抗原刺激以后与对照相比淋巴细胞发生了增殖，同时刺激产生了IFN-γ、IL-6和IL-10细胞因子。综上所述，该重组蛋白不但能刺激机体产生很好的体液免疫，还能诱导机体发生细胞免疫，为以后绵羊支原体肺炎多表位疫苗的研究奠定了基础。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-12
第一章引言  12-16
  1.1 绵羊肺炎支原体的研究进展  12-14
    1.1.1 分类地位及形态特征  12
    1.1.2 培养特性与生物学特征  12-13
    1.1.3 流行病学  13-14
    1.1.4 致病机理  14
  1.2 绵羊支原体肺炎疫苗的研究进展  14-15
  1.3 研究的目的和意义  15-16
第二章 EF-Tu 基因的合成及重组蛋白免疫原性的验证  16-26
  2.1 材料  16-18
    2.1.1 菌株和血清  16
    2.1.2 质粒和主要试剂  16
    2.1.3 EF-Tu 基因的克隆及优化合成  16
    2.1.4 重组质粒的构建  16-17
    2.1.5 重组蛋白的表达  17
    2.1.6 重组蛋白的纯化  17
    2.1.7 Western-blot 检测  17-18
    2.1.8 EF-Tu 蛋白免疫小鼠  18
    2.1.9 ELISA 检测血清抗体  18
  2.2 实验结果  18-25
    2.2.1 EF-Tu 基因的克隆  18-19
    2.2.2 Mo EF-Tu 基因序列的分析  19-21
    2.2.3 重组质粒的鉴定  21-22
    2.2.4 重组蛋白的表达鉴定  22-23
    2.2.5 重组蛋白的纯化鉴定  23
    2.2.6 Western-blot 检测结果  23-24
    2.2.7 血清抗体检测结果  24-25
  2.3 讨论  25-26
第三章 EF-Tu、PDHA 和 Hsp70 表位的筛选  26-38
  3.1 材料与方法  26-27
    3.1.1 实验动物  26
    3.1.2 主要试剂和仪器  26
    3.1.3 EF-Tu 和 PDHA T 细胞表位的预测及多肽合成  26
    3.1.4 EF-Tu 和 PDHA B 细胞表位的预测及多肽合成  26
    3.1.5 T 细胞表位的鉴定  26
    3.1.6 B 细胞表位的鉴定  26-27
    3.1.7 Hsp70 表位的筛选  27
  3.2 实验结果  27-36
    3.2.1 T-cell 表位的筛选  27-30
    3.2.2 B-cell 表位的筛选  30-36
  3.3 讨论  36-38
第四章串联体的构建以及重组质粒在大肠杆菌中的表达  38-43
  4.1 材料与方法  38-39
    4.1.1 质粒  38
    4.1.2 主要试剂  38
    4.1.3 串联体的筛选及合成  38
    4.1.4 重组质粒的构建  38
    4.1.5 重组蛋白的表达鉴定  38-39
    4.1.6 重组蛋白的纯化  39
    4.1.7 Western-blot 检测  39
  4.2 实验结果  39-42
    4.2.1 串联体的筛选  39-40
    4.2.2 重组质粒的 PCR 及测序鉴定  40
    4.2.3 重组蛋白的表达鉴定  40-41
    4.2.4 重组蛋白的纯化  41-42
    4.2.5 Western-blot 检测结果  42
  4.3 讨论  42-43
第五章重组蛋白免疫效果的评价  43-48
  5.1 材料与方法  43-44
    5.1.1 菌株和血清  43
    5.1.2 质粒  43
    5.1.3 主要试剂  43
    5.1.4 实验动物  43
    5.1.5 重组蛋白免疫小鼠  43
    5.1.6 ELISA 检测血清抗体  43-44
    5.1.7 T 淋巴细胞增殖实验  44
    5.1.8 细胞因子 IFN-γ、IL-6 和 IL-10 的检测  44
  5.2 实验结果  44-47
    5.2.1 血清抗体的检测  44
    5.2.2 T 淋巴细胞增殖实验结果  44-46
    5.2.3 细胞因子 IFN-γ、IL-6 和 IL-10 的检测结果  46-47
  5.3 讨论  47-48
第六章全文结论  48-49
参考文献  49-54
致谢  54-55
作者简历  55

绵羊肺炎支原体多表位疫苗的研究及免疫试验

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