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热休克蛋白70基因多态性与接尘工人遗传易感性的关系

作　者: 秦卫东
导　师: 姚武；周舫
学　校: 郑州大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 热休克蛋白70 基因多态性尘肺
分类号: R131
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

尘肺病是目前我国职业病中发病率最高、死亡危险性较大、对工人健康危害最严重的一类法定职业病,发病人数多,分布范围广,治疗困难。据卫生部统计目前我国尘肺病累计发病近64万人,占职业病发病人数80%,近几年,每年发病近2万例,尘肺病发病机制尚不清楚,尚无法对其进行早期预警和诊断,也没有根治或阻止肺纤维化进展的有效方法,防治的关键在于预防。因此,及时检出易感者,限制其从事接触粉尘的工作是非常重要的预防措施之一。自从1962年热休克蛋白被发现以来,国内外的研究者对其进行了大量的研究。研究表明:热休克蛋白家族是迄今为止发现最为保守的家族,在细胞的应激保护过程中起着至关重要的作用,其中研究最多的是热休克蛋白70家族。最近的研究表明,编码伴侣蛋白的基因多态性与纤维化疾病的易感性密切相关。目前,关于热休克蛋白70基因多态性的研究刚刚起步,而且多数研究是针对培养细胞或动物,大规模的人群调查尚不多见。随着对热休克蛋白70研究的不断深入,其在职业卫生学方面的价值也逐渐体现出来,有学者提出用热休克蛋白抗体作为职业危害的早期生物标志物。如果可以揭示出病变组织和正常组织中差异表达的热休克蛋白70,就有可能找到和疾病相关的基因和蛋白质,找到和疾病相关的分子生物标记物。热休克蛋白70在多种条件下都可能产生有意义的表达,有研究表明热休克蛋白70在矽肺病人中高表达。可见其与尘肺病的发生发展可能密切相关。因此,本研究通过职业流行病学调查与实验室研究相结合的方法,对接尘工人热休克蛋白70基因多态性及其分布状况进行研究,以中国河南省某煤矿汉族工人200例为研究对象,采集外周静脉血,提取全血DNA,采用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性（PCR-RFLP）技术对所有研究对象的热休克蛋白70基因HSP70-1+190位点、HSP70-2+1267位点和HSP70-hom+2437位点的多态性进行检测,初步探讨热休克蛋白70基因多态性在煤工尘肺发病中可能的作用,以期阐明基因多态性与煤工尘肺等纤维化疾病的遗传易感性关系提供相关线索和理论依据,为进一步改进粉尘危害的控制措施和早期预防提供新的思路和手段。材料与方法一、研究对象1.无尘肺0⁺组:由河南省平顶山市职业病防治所按现行《尘肺X线诊断标准》（GBZ70-2002）判定结果为参照,出现0⁺变化的工人100例,所有对象均自愿合作,无免疫系统疾病和其它肺部疾病。接尘工种均系掘进工,粉尘类型为混合尘。2.无尘肺组:在同一矿区选择男性汉族胸片结果正常的掘进工100例,排除免疫系统疾病和其它肺部疾病。每位研究对象均接受研究者的问卷调查,内容包括:个人一般情况、粉尘作业史、年龄、工龄、尘肺病诊断史、既往史和家族史等。二、血样采集和DNA提取全部研究对象取清晨空腹外周静脉血3ml,置含乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝剂的真空无菌管中混匀,采用Axe-gene生物公司的全血细胞DNA提取试剂盒提取新鲜血样中的DNA,-20℃保存备用。三、热休克蛋白70基因多态性分析1.根据文献报道,合成3对引物。扩增HSP70-1的引物序列为:上游5′-TCC GGC GTC CGG AAG GAC C-3′下游5′-TGC GGC CAA TCA GGC GCT T-3′扩增HSP70-2的引物序列为:上游5′-CAT CGA CTT CTA CAC GTC CA-3′下游5′-CAA AGT CCT TGA GTC CCA AC-3′扩增HSP70-hom的引物序列为:上游5′-GGA CAA GTC TGA GAA GGT ACA G-3′下游5′-GTA ACT TAG ATT CAG GTC TGG-3′2.通过DNA聚合酶链反应（PCR）分别扩增3个基因。PCR反应体系为:10×Buffer 2.5μl,DNTP 2.0μl,上游引物1μl,下游引物1μl,Taq酶0.25μl,H₂O 15.25μl,DNA 3μl;PCR反应条件分别为:HSP70-1:94℃5min→94℃30s→54.5℃30s→72℃45s→35个循环→72℃10min;HSP70-2:94℃3min→94℃1min→61℃1min→72℃2min→35个循环→72℃10min;HSP70-hom::94℃2min→94℃45s→57℃45s→72℃1min→35个循环→72℃5min。3.采用限制性内切酶分别处理3种PCR产物,酶切反应体系和条件如下。HSP70-1反应体系:10×Buffer 1μl,BsrBI 0.25μl,H₂O 3.75μl,PCR产物5μl;反应条件:37℃消化4h电泳条件:2.5%琼脂糖,60v,2.5h,溴乙锭（EB）染色,经成像系统成像后保存。HSP70-2反应体系:10×Buffer 1μl,100×BSA 0.1μl,PstI 0.25μl,H₂O 3.65μl,PCR产物5μl;反应条件:37℃消化16h电泳条件:1.5%琼脂糖,60v,2h,溴乙锭（EB）染色,经成像系统成像后保存。HSP70-hom反应体系:10×Buffer 1μl,NcoI 0.25μl,H₂O 3.75μl,PCR产物5μl;反应条件:37℃消化4h电泳条件:2%琼脂糖,60v,2h,溴乙锭（EB）染色,经成像系统成像后保存。4.质量控制:实验过程从血样采集、登记编号、样品保存、器具的消毒等均严格按照实验操作规程。聚合酶链反应（PCR）扩增和限制片段长度多态性（RFLP）分析均每次设1个空白对照;对无法判断结果的样品重复实验。四、统计学分析应用Excel2000对全部调查和测定结果建立数据库,SPSS13.0软件包进行数据的统计分析。应用Logistic回归对HSP70-1、HSP70-2、HSP70-hom基因多态性、吸烟指数、接尘工龄等因素进行多元回归分析。检验水准α=0.05。结果一、调查对象的一般情况无尘肺0⁺组100例,年龄为18～50（36.74±5.21）岁,接尘工龄为3～40（18.35±7.57）年;无尘肺组年龄为19～49（37.65±4.28）岁,接尘工龄为2～37（17.18±6.92）年。两组间年龄、接尘工龄、身高、体重、身体状况、文化程度、烟酒史等差异均没有统计学意义（P＞0.05）,具有可比性。二、三组间不同基因型分布比较结果表明,HSP70-1基因+190位点b2/b2基因型在两组间分布不平衡,无尘肺0⁺组明显高于无尘肺组,两组间差异有统计学意义（P＜0.05）,OR值为2.357;而HSP70-2和HSP70-hom的多态性在两组间差异没有统计学意义（P＞0.05）。三、Logistic多元回归分析结果HSP70-1基因中突变基因型比野生纯合型基因发生煤工尘肺的可能性更高（P＜0.05,OR=2.401,CI=1.315-8.320）。吸烟指数对可能发生煤工尘肺的危险程度没有统计学意义。（HSP70-1:吸烟指数＜20包年,P＞0.05,OR=1.56,CI=0.53-4.59,≥20包年,P＞0.05,OR=1.43,CI=0.65-3.15;HSP70-2:吸烟指数＜20包年,P＞0.05,OR=2.01,CI=0.83-6.24,≥20包年,P＞0.05,OR=1.00,CI=0.56-1.78;HSP70-hom:吸烟指数＜20包年,P＞0.05,OR=1.61,CI=0.80-3.25,≥20包年,P＞0.05,OR=1.33,CI=0.68-2.60）。接尘工龄对可能发生煤工尘肺的危险程度没有统计学意义。（HSP70-1:P＞0.05,OR=1.08,CI=0.62-1.86;HSP70-2:P＞0.05,OR=1.02,CI=0.74-2.41;HSP70-hom:P＞0.05,OR=0.88,CI=0.38-2.05）。结论1.接尘工人热休克蛋白70基因存在多态性。2.接尘人群中HSP70-1基因b2/b2基因型分布差异有统计学意义,可能与煤工尘肺的发生相关。

全文目录

中文摘要  3-7
Abstract  7-11
论文部分  11-42
  前言  11-15
  材料和方法  15-21
  结果  21-29
  讨论  29-35
  结论  35-36
  参考文献  36-42
综述部分  42-59
  综述  42-53
  参考文献  53-59
缩略词表  59-61
后记  61

热休克蛋白70基因多态性与接尘工人遗传易感性的关系

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