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吉林省羊传染性脓疱病流行病学调査及其灭活疫苗的研制

作　者: 郭良兴
导　师: 高丰
学　校: 吉林大学
专　业: 兽医
关键词: 羊传染性脓疱病毒流行病学分离鉴定油乳剂灭活疫苗研制
分类号: S858.26
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

羊传染性脓疱病（Contagious ecthyma, CE）又名羊接触传染性脓疱性口炎、羊传染性脓疱性皮炎、羊口疮等，是由传染性脓疱病毒（Orf virus, ORFV）感染引起山羊、绵羊和人的一种急性、接触性和嗜上皮性的人兽共患病，以在患羊的口唇、蹄、乳房、外阴等处皮肤和黏膜形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和疣状厚痂为特征。目前，该病广泛存在世界各养羊国家和地区，我国北方、西北等主要的养羊省区羊群中也不断有该病发生和流行的报道，因此该病的发生给世界养羊业造成了巨大的经济损失。由于ORFV具有较强的抵抗力，羊群在被感染后不易于清除，可持续多年对羊群造成危害。此外，ORFV也可通过直接接触感染人，尤其是牧民、兽医师及从事剪毛、屠宰、饲养及皮毛加工的工作人员，严重威胁着人类的健康，成为影响我国乃至世界公共卫生安全的一个重要隐患。近年来，该病的发生呈不断上升的趋势，成为当前严重危害养羊业的主要疫病之一。为了解近年来羊传染性脓疱病在吉林省的流行情况，本研究采用PCR方法对2006～2010年间采自吉林省9个不同市县85个养羊户疑似羊传染性脓疱病毒感染的628份痂皮样本（背部、乳房、四肢以及尾根等部位皮肤）进行羊传染性脓疱病毒核酸的检测，应用间接ELISA方法对同期采集自上述地区羊群中的2160份血清样本进行羊传染性脓疱病毒抗体检测。通过调查其在吉林省羊群中的感染分布情况，初步阐明其流行规律。这不仅为研究病毒的分子致病机制奠定基础，而且将为针对感染现状日益严重的羊传染性脓疱病科学防控措施的制定提供重要的理论依据。分子流行病学调查结果显示，在各地区不同年龄段不同品种羊的痂皮组织中均可检测出ORFV核酸，羊群中ORFV感染的平均阳性率为56.47%(48/85)，痂皮样品中平均阳性检出率为24.36%(153/628)，且各地区羊群中ORFV阳性率从16.42%～32.60%不等，其中以松原、白城地区的阳性率较高；血清学调查结果显示，吉林省各市县的ORFV血清抗体阳性率从18.95%～53.49%不等，其中农安、松原和白城地区的羊群中ORFV抗体阳性率相对较高。以上的调查结果表明，ORFV在吉林省羊群中长期带毒存在，感染非常普遍，且呈持续性流行状态。此外，本研究还对不同日龄、不同性别以及不同品种羊的ORFV感染情况进行了调查分析，以上的流行病学调查结果将为吉林省针对ORFV的防控提供重要的理论依据。为了探明吉林省ORFV地方流行毒株的类型和分子特征，进而为当地针对羊传染性脓疱病的防控工作提供科学依据和物质基础，本研究通过病原分离、电镜负染观察、动物回归试验、PCR等方法对ORFV病毒核酸检测为阳性的病料进行系统的病原分离及鉴定。本研究对2010年白城地区某羊群中疑似ORFV感染病例进行了系统的病原分离与鉴定，以从病原学角度证实该病在羊群中发生的原因。首先，分别利用原代胎羊鼻甲骨细胞（OFTu）和牛肾细胞（MDBK）进行病原的分离，OFTu细胞在盲传至第2代时即出现典型的CPE；而MDBK细胞用于病毒分离时，在盲传至第五代时出现CPE；将细胞病变液经蔗糖密度梯度（W/V）离心纯化后进行电镜负染观察，可见到呈椭圆形、毛线团样外观的典型的副痘病毒粒子，结果表明我们成功分离获得了1株病毒；为进一步鉴定该病毒分离株，本研究设计合成了针对ORFV、CPV、BTV、FMDV的特异性引物以进行类症鉴别，PCR或RT-PCR检测结果显示，仅ORFV引物的扩增结果为阳性，排除了CPV、BTV、FMDV感染的可能性，从而证实了该病毒分离株为ORFV。为进一步了解该分离株在OFTu细胞中的增殖能力及其动态的侵袭过程，本研究制作了ORFV感染OFTu细胞后不同时间段的超薄切片对感染细胞的超微结构和病毒粒子的形态学发生过程进行观察，在感染初期，以对损伤最为敏感的线粒体的变化较为显著，线粒体肿胀、变形严重，线粒体嵴断裂、消失；至感染后期，粗面内质网也发生高度扩张，核周隙增大，感染细胞胞浆中可见有大量椭圆形的成熟病毒粒子，这表明ORFV在感染细胞胞浆中成功地进行了复制。此外，本研究还利用OFTu细胞对其毒力进行了测定，结果显示，该ORFV分离株在OFTu细胞上的感染滴度为10-8.33/0.1mL，该结果表明该分离株的毒力较强；为进一步确定该分离株的致病性，本研究利用对ORFV易感的家兔和本源动物羔羊进行动物回归试验，均复制出与自然感染相类似的临床症状。以上我们对ORFV白城分离株进行了系统全面的鉴定，并从病原学角度对其致病性进行了初步的研究分析，据此从而确诊该病的发生是ORFV野毒感染所致。由于目前吉林省羊群中ORFV感染的状况仍非常普遍，且目前尚无有效的方法用于该病的防治，因此利用ORFV地方分离毒株研制安全高效的疫苗对于该病的防治具有重要的现实意义。本研究选用分离获得的ORFV吉林省地方分离毒株作为疫苗研制的候选毒株，通过优化体外增殖条件，确定利用OFTu细胞进行ORFV的增殖传代。在确定ORFV最佳增殖条件的基础上，本研究将经分离鉴定后冻干保存的ORFV吉林白城分离毒株定为F0代，接种于OFTu细胞中进行复苏传代，制备出原始种子库（F3代）和基础种子库（F6代），并对其第3代培养物（原始种子：F6；基础种子：F9）的培养特性、纯净度、毒力等进行测定，检测结果表明，所建立的ORFV原始种子库和基础种子库符合“兽用新生物制品质量标准”。之后，取基础种子库的病毒液制备生产种子用于生产疫苗用抗原，收集病毒效价（TCID50）达10-7.0/0.1mL以上的病毒液，经0.4%甲醛灭活后制备ORFV油乳剂灭活疫苗。随机抽取疫苗样本的检测结果表明，其物理性状检验、无菌检验和支原体检验均符合《中国兽药典》和《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》；安全性试验结果显示，所制备的3批疫苗均较为安全。以上结果表明，本研究制备出了安全合格的ORFV油乳剂灭活疫苗。动物免疫试验结果表明，所制备的ORFV油乳剂灭活疫苗主要刺激机体的Th1型免疫应答反应，而诱导产生的抗体水平较低；攻毒保护性试验结果显示，所制备的ORFV油乳剂灭活疫苗能够产生有效的免疫保护力。以上研究成果的取得将为临床上针对羊传染性脓疱病的防控以及在羊群中的清除提供重要的物质基础和技术支撑。

全文目录

中文摘要  4-7
Abstract  7-13
英文缩写词表  13-15
前言  15-17
第一篇文献综述  17-43
  第1章羊传染性脓疱病毒的研究进展  17-31
    1.1 病毒基因组特征  18-21
    1.2 流行病学特点  21-23
    1.3 诊断方法研究  23
    1.4 免疫调节机制  23-27
    1.5 宿主抗病毒免疫  27-28
    1.6 ORFV 载体的应用  28-29
    1.7 灭活 ORFV 的免疫增强作用  29
    1.8 小结  29-31
  第2章羊传染性脓疱病毒的致病机理、免疫特性及疫苗研究  31-43
    2.1 ORFV 的致病机理  31-33
    2.2 抗副痘病毒免疫反应  33-35
    2.3 副痘病毒的免疫逃逸  35-38
    2.4 痘病毒编码的免疫调节蛋白  38-40
    2.5 灭活副痘病毒的调节机制  40
    2.6 副痘病毒疫苗免疫和重组疫苗  40-42
    2.7 小结  42-43
第二篇研究内容  43-97
  第1章吉林省羊传染性脓疱病流行病学调查及分析  43-55
    1.1 材料和方法  44-47
    1.2 结果  47-51
    1.3 讨论  51-53
    1.4 小结  53-55
  第2章吉林省羊传染性脓疱病毒的分离鉴定  55-71
    2.1 材料与方法  55-61
    2.2 结果  61-67
    2.3 讨论  67-69
    2.4 小结  69-71
  第3章羊传染性脓疱病毒白城分离株油乳剂灭活疫苗的制备  71-85
    3.1 材料与方法  71-78
    3.2 结果  78-82
    3.3 讨论  82-84
    3.4 小结  84-85
  第4章羊传染性脓疱病毒油乳剂灭活疫苗的免疫试验研究  85-97
    4.1 材料与方法  85-89
    4.2 结果  89-94
    4.3 讨论  94-95
    4.4 小结  95-97
结论  97-99
参考文献  99-113
攻博期间发表的论文  113-115
导师及作者简介  115-117
致谢  117

吉林省羊传染性脓疱病流行病学调査及其灭活疫苗的研制

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