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猪瘟病毒慢性感染对细胞因子转录的影响

作　者: 张正兴
导　师: 王琴
学　校: 中国兽医药品监察所
专　业: 预防兽医学
关键词: CSFV中等致病力毒株 HCLV 细胞因子实时荧光定量PCR
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

猪瘟(Classical Swine Fever, CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)引起的猪的高度接触性、传染性疾病,给养猪业造成巨大威胁和经济损失,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的法定传染病之一。CSFV中等致病力毒株造成慢性感染,疫苗株能对机体产生免疫保护作用。通过研究CSFV中等致病力毒株和疫苗株体外感染猪外周血单核细胞(PBMC)及人工感染实验用猪后,对细胞因子转录和表达的影响,系统分析CSFV中等致病力毒株感染及疫苗免疫对机体免疫系统的影响,为阐释CSF慢性感染的机制提供理论依据。分别使用CSFV中等致病力毒株HeBHH1/95及HCLV体外感染PBMC,在24hpi、48hpi,运用qRT-PCR技术对白介素、趋化因子、毒性反应相关分子、IL-1β转换酶、粘附分子、抗病毒作用相关分子、干扰素及干扰素调控因子、细胞因子受体共59种免疫相关分子进行全面测定。结果显示：在24hpi, HeBHH1/95感染引起9种细胞因子转录水平上调,50种下调,MCP-1、IL-lα IL-1β、IL-8、IL-6转录水平显著上调(RQ>2.1)。IL-la转录水平上调最显著(RQ=3.16), IFN-a转录水平下调最显著(RQ=0.54);HCLV感染引起9种细胞因子转录水平上调,50种下调,MCP-1、 IL-1a、IL-1β、IL-8、IL-10、TGF-β2转录水平上调(RQ>2)。MCP-1转录水平上调最显著(RQ=3.02),IFN-α转录水平下调最显著(RQ=0.447)。在48hpi, HeBHH1/95。感染引起12种细胞因子转录水平上调,TLR-4和IFN-α不变,45种下调,IL-lα、MCP-1IL-8转录水平上调最显著(RQ>2),IL-1α转录水平上调最显著(RQ=2.75), IL-12p35转录水平下调最显著(RQ=0.427); HCLV感染引起12种细胞因子转录水平上调,47种下调,MCP-1、IL-lα、IL-1β、IL-8转录水平显著上调(RQ>2.3)。 IL-1α转录水平上调最显著(RQ=2.63),TGF-R转录水平下调最显著(RQ=0.295)。HeBHH1/95与HCLV体外感染均能导致PBMC体外培养系免疫相关因子转录水平变化,IL-lα、 IL-1β、IL-8等炎性相关因子转录水平均显著升高,毒性反应相关分子、IL-1β转换酶、粘附分子类细胞因子均显著下降,但在抗病毒因子转录改变机制上具有差异,如HCLV诱导Rantes上升,HeBHH/95则下调。综上所述,提示CSFV中等致病力毒株HeBHH1/95和HCLV体外感染24hpi和48hpi均可诱导机体炎症反应,但在诱导机体细胞抗病毒感染应答机制上具有差异。将23头实验用猪(60日龄)随机分为攻毒组、疫苗组和对照组,定期采血(O dpi、1dpi、2dpi、5dpi、7dpi、9dpi、12dpi、16dpi、20dpi、23dpi、28dpi、30dpi、35dpi、43dpi),采用qRT-PCR技术、流式细胞仪和ELISA技术,检测猪外周血中10种细胞因子转录水平、淋巴细胞亚群分析和猪瘟抗体水平。结果显示：HeBHH1/95感染组实验猪存活43dpi以上,在感染过程中T淋巴细胞减少和免疫抑制是猪瘟慢性感染早期的临床特征,具有直接杀伤能力的γ6T细胞、杀伤性T细胞和辅助型T细胞的数量降低均开始于2dpi,而不具备直接杀伤能力的活化记忆T细胞数量的降低开始于9dpi。在HeBHH1/95感染后,所有检测抗病毒因子(IL-la、IL-2、IL-4、 IL-8、IFN-a、IFN-p、 TNF, Mxl、PKR和OAS)均显著上升。HCLV免疫组在5-7dpi时淋巴细胞绝对数量略有上升,在12dpi到达高峰,对照组差异显著(P<0.05),而后逐渐下调并趋于稳定。进一步的流式细胞仪检测结果显示淋巴细胞数量的提升主要是由于辅助性T细胞数量的增多。在HCLV免疫组中,CSFV抗体开始呈现阳性(阻断率>40%)出现在9-12dpi之间,在此期间IL-8转录水平大幅上调,这两者增长与抗体形成的相关性揭示了Th细胞通过增殖诱导B淋巴细胞成熟,诱导细胞因子表达产生特异性CSFV抗体,并形成免疫保护机制。综上所述,通过对CSFV体外PBMC感染和实验动物CSFV慢性感染/免疫后的各免疫相关因子动态变化进行全面研究,通过比较感染前/后和免疫前/后各指标变化,分析了病毒在逃避宿上免疫过程和形成特异性抗体中起关键作用的细胞及细胞因子的动态变化,为探索细胞因子作用奠定的基础,为阐述CSFV慢性感染和免疫的机制提供理论科学依据。

全文目录

中文摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
目录  7-9
缩略语中英文对照表  9-10
插图及附表清单  10-11
第一章文献综述  11-23
  1.1 猪瘟概述  11-12
  1.2 猪瘟病毒病原学及流行分布  12-13
    1.2.1 猪瘟病毒病原学  12
    1.2.2 猪瘟兔化弱毒疫苗研究  12-13
    1.2.3 猪瘟国内外流行分布  13
  1.3 猪瘟病毒感染类型  13-14
    1.3.1 猪瘟病毒感染类型  13-14
    1.3.2 猪瘟持续性感染研究  14
  1.4 细胞因子表达水平与病毒感染的关系  14-23
    1.4.1 细胞因子功能及作用特点  14-15
    1.4.2 细胞因子在病毒感染和免疫上的作用  15-17
    1.4.3 细胞因子检测技术研究进展  17-19
    1.4.4 细胞因子抗猪瘟病毒感染免疫作用  19-23
第二章前言  23-27
  2.1 研究目的及意义  23-24
  2.2 研究内容和技术路线  24-27
    2.2.1 研究内容  24
    2.2.2 技术路线  24-27
第三章 CSFV HeBHH1/95株和HCLV体外感染对PBMC细胞因子转录的影响  27-47
  摘要  27-28
  3.1 材料  28-29
    3.1.1 实验用猪和毒株  28
    3.1.2 酶及其试剂  28
    3.1.3 主要器材  28-29
  3.2 方法  29-33
    3.2.1 qRT-PCR技术检测各种细胞因子方法的建立  29-32
    3.2.2 猪外周单核细胞的分离与制备  32
    3.2.3 cDNA的合成  32-33
    3.2.4 qRT-PCR检测细胞因子转录水平  33
    3.2.5 数据分析  33
  3.3 结果  33-40
    3.3.1 CSFV HeBHH1/95株和HCLV体外感染对外周血白介素类转录的影响  33-35
    3.3.2 CSFV HeBHH1/95株和HCLV体外感染对外周血趋化因子转录的影响  35-36
    3.3.3 CSFV HeBHH1/95株和HCLV体外感染对外周血干扰素类及其干扰素调控因子转录的影响  36-37
    3.3.4 CSFV HeBHH1/95株和HCLV体外感染对外周血粘附因子及抗病毒作用因子等转录的影响  37-38
    3.3.5 CSFV HeBHH1/95株和HCLV体外感染对外周血Toll样受体转录的影响  38-39
    3.3.6 CSFV HeBHH1/95株和HCLV体外感染对外周血细胞因子受体转录的影响  39-40
  3.4 讨论  40-46
    3.4.1 qRT-PCR技术检测细胞因子方法的优势  40-41
    3.4.2 CSFV HeBHH1/95株和HCLV体外感染对外周血细胞因子转录的影响  41-46
  3.5 小结  46-47
第四章 CSFV HeBHH1/95株感染和HCLV免疫对猪免疫相关因子的影响  47-66
  摘要  47-48
  4.1 材料  48
    4.1.1 毒株  48
    4.1.2 实验用猪  48
    4.1.3 酶和荧光定量PCR试剂  48
    4.1.4 流式细胞仪相关试剂  48
    4.1.5 其他试剂  48
  4.2 方法  48-51
    4.2.1 实验动物分组  49
    4.2.2 样品采集  49
    4.2.3 外周血免疫相关细胞血液常规及免疫细胞检测  49
    4.2.4 外周血单个核细胞的分离  49
    4.2.5 总RNA的抽提与反转录  49-50
    4.2.6 感染和免疫后不同时间血液中CSFV病毒和疫苗核酸载量的测定  50
    4.2.7 感染和免疫后不同时间血液中CSFV抗体的检测  50
    4.2.8 qRT-PCR对各细胞因子基因转录水平进行检测  50-51
    4.2.9 统计学分析  51
  4.3 结果  51-62
    4.3.1 CSFV HeBHH1/95株感染和HCLV免疫对猪的临床症状  51-52
    4.3.2 CSFV HeBHH1/95株感染和HCLV免疫对外周血中核酸载量的动态变化  52-53
    4.3.3 CSFV HeBHH1/95株感染和HCLV免疫对外周血中特异性抗体的动态  53-54
    4.3.4 CSFV HeBHH1/95株感染和HCLV免疫对外周血淋巴细胞生物学分析  54-57
    4.3.5 CSFV HeBHH1/95株感染和HCLV免疫细胞因子转录的影响  57-62
  4.4 讨论  62-64
    4.4.1 CSFV HeBHH1/95株感染和HCLV免疫对外周血淋巴细胞的影响  62-63
    4.4.2 CSFV HeBHH1/95株感染和HCLV免疫对外周血细胞因子转录的影响  63-64
  4.5 小结  64-66
第五章结论与创新  66-67
  5.1 结论  66
  5.2 创新  66-67
参考文献  67-71
致谢  71-73
附录猪临床打分表  73-75
作者简介  75

猪瘟病毒慢性感染对细胞因子转录的影响

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