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呋喃妥因代谢物AHD快速检测技术研究

作　者: 石金磊
导　师: 王权
学　校: 中国农业科学院
专　业: 兽医
关键词: 兽药残留呋喃妥因单克隆抗体快速检测技术
分类号: S859.84
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

近年来，动物源性食品中兽药残留问题越来越受到人们的关注。随着抗菌药物的广泛应用，发现大剂量或长时间使用硝基呋喃类药物会对动物机体产生一系列不良反应并具有三致毒害，且其代谢物在体内残留时间长达数周，为了保证动物源性食品的安全，各国均将其列为禁用药物，但由于硝基呋喃类药物抗菌谱广、价格低廉，仍有养殖人员违法使用。呋喃妥因是硝基呋喃类药物中常用的一种，其毒性仅次于呋喃西林，目前国内采用ELISA方法和化学发光方法（CLIA）检测呋喃妥因残留的报道均较少，且灵敏度有提高的必要，这就需要建立一种快速灵敏的检测方法来满足批量样品筛选检测要求。本试验探索采用了Jeffamine偶联方法，成功制备了包被原，用之筛选获得高特异性的呋喃妥因单克隆抗体，并建立了的两种检测呋喃妥因的ELISA方法，通过对重要指标的比较确定了直接竞争ELISA检测性能优于间接竞争ELISA，采用前者的技术路线建立了化学发光分析方法，为研制检测呋喃妥因灵敏、稳定的化学发光检测试剂盒奠定了基础。具体实验工作如下：1.采用活化酯法将4-CPAHD与载体蛋白BSA和OVA分别偶联，制备了免疫原CPAHD-BSA和检测抗原CPAHD-Jeffamine-OVA，并通过紫外扫描和SDS-PAGE鉴定偶联成功，用CPAHD-BSA免疫小鼠后，利用杂交瘤技术研制呋喃妥因代谢物AHD单克隆抗体，获得1B10、3C3、3G103株能稳定分泌抗体的细胞株，用间接竞争ELISA鉴定抗体特异性和灵敏度。结果证明所得单克隆抗体除与呋喃妥因有部分交叉外，与衍生试剂、其它硝基呋喃类原药及代谢物药物均无交叉反应，抗体1B10的IC₅₀为3.56ng/mL。表明将CPAHD和载体蛋白OVA之间加入Jeffamine作为间隔臂，最大程度保持和突出了载体远端的CPAHD半抗原的特征结构，用之作包被原能成功地筛选出更高亲和性的单克隆抗体。2．利用偶联成功的酶标药物与待测抗原竞争包被在酶标板上的抗体的原理建立直接竞争ELISA法，标准曲线回归方程为y=-0.3615x+0.6263，R²=0.9910，IC₅₀为2.236ng/mL；以CPAHD-Jeffamine-OVA为包被抗原建立间接竞争ELISA法，标准曲线回归方程为y=-0.4197x+0.7343，R²=0.9985，IC₅₀为3.616ng/mL。通过对两种检测方法的灵敏度、精确度及稳定性的比较，确定直接竞争ELISA法为更好的检测方法，为化学发光方法的建立提供了技术路线。3.以直接竞争ELISA方法的技术路线为基础建立了化学发光分析方法，标准曲线回归方程为y=-0.3659x+0.5115，R²=0.9852，IC₅₀为1.076ng/mL，对4-NPAHD标准品的最低检出限为0.303ng/mL，经过对鱼肉组织样品前处理后，计算直接化学发光法对样品的最低检出限为0.587ng/mL，精确度良好，对AHD的添加回收率为82%-94%之间，准确度较高。与进口试剂盒相比，灵敏度、精确度和准确度相当，表明本试验建立的直接化学发光方法能够满足对呋喃妥因残留实际检测的需要。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-13
第一章前言  13-19
  1.1 兽药残留的危害  13-14
  1.2 硝基呋喃类药物的简介  14-15
    1.2.1 硝基呋喃类药物的性质  14
    1.2.2 硝基呋喃类药物残留现状  14-15
  1.3 硝基呋喃类药物检测方法  15-18
    1.3.1 仪器检测法  15-17
    1.3.2 免疫分析法  17-18
  1.4 本课题研究的内容与意义  18-19
第二章呋喃妥因代谢物 AHD 完全抗原及单抗的制备与鉴定  19-34
  2.1 材料与方法  19-27
    2.1.1 实验动物  19
    2.1.2 主要试剂和仪器  19-20
    2.1.3 实验相关试剂配制  20-21
    2.1.4 完全抗原制备与鉴定  21-22
    2.1.5 小鼠免疫试验及最佳小鼠的选择  22-23
    2.1.6 单抗制备与鉴定  23-26
    2.1.7 单抗的生产与纯化  26
    2.1.8 单抗灵敏度（即半数抑制的质量浓度）的初步测定  26-27
    2.1.9 单抗特异性的鉴定  27
  2.2 结果与分析  27-32
    2.2.1 抗原紫外扫描  27-28
    2.2.2 完全抗原的 SDS-PAGE 电泳鉴定  28-29
    2.2.3 最佳免疫小鼠的选择  29-30
    2.2.4 细胞融合过程及观察  30
    2.2.5 阳性克隆的筛选  30
    2.2.6 阳性克隆的亚克隆  30
    2.2.7 腹水的制备与纯化  30
    2.2.8 AHD 单抗细胞株 1B10、3C3、3G10 性质比较  30-31
    2.2.9 4-NPAHD 半数抑制浓度的测定  31-32
    2.2.10 交叉反应  32
  2.3 讨论  32-34
第三章呋喃妥因代谢物 AHD 检测方法的选择  34-46
  3.1 材料与方法  34-38
    3.1.1 主要试剂和仪器  34-35
    3.1.2 直接竞争 ELISA 检测方法的建立和优化  35-36
    3.1.3 间接 ELISA 方法的建立和优化  36-37
    3.1.4 直接竞争 ELISA 与间接竞争 ELISA 方法的比较  37-38
    3.1.5 依据较好 ELISA 方法的技术路线建立化学发光分析方法的重要指标 IC_(50)观察  38
  3.2 结果与分析  38-44
    3.2.1 直接竞争 ELISA 检测方法建立和优化  38-39
    3.2.2 间接竞争 ELISA 检测方法建立和优化  39-40
    3.2.3 直接竞争 ELISA 与间接竞争 ELISA 方法的比较  40-44
    3.2.4 直接 ELISA 方法与化学发光方法 IC_(50)的比较  44
  3.3 讨论  44-46
第四章呋喃妥因化学发光检测技术的建立与应用  46-55
  4.1 材料与方法  46-48
    4.1.1 主要试剂和仪器  46-47
    4.1.2 直接 CLIA 标准曲线的建立  47
    4.1.3 样品的前处理  47
    4.1.4 最低检出限试验  47-48
    4.1.5 精确度试验  48
    4.1.6 特异性试验  48
    4.1.7 准确度试验  48
    4.1.8 与进口 ELISA 试剂盒比较试验  48
  4.2 结果  48-54
    4.2.1 CLIA 标准曲线的建立  48-49
    4.2.2 最低检出限试验  49
    4.2.3 精确度试验  49-50
    4.2.4 特异性试验  50-51
    4.2.5 准确度试验  51-52
    4.2.6 与进口 ELISA 试剂盒比较试验  52-54
  4.3 讨论  54-55
第五章全文结论  55-56
参考文献  56-60
致谢  60-61
作者简介  61

呋喃妥因代谢物AHD快速检测技术研究

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