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以重组NP为抗原GPMV抗体间接ELISA检测方法的建立

作　者: 刘立峰
导　师: 王君伟
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鹅副粘病毒重组NP蛋白 ELISA
分类号: S858.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 63次
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内容摘要

1997年以来，在我国许多地区爆发了由鹅副粘病毒(Goose Paramyxovirus，GPMV)引起的鹅的烈性传染病。该病是以消化道和呼吸道病变为主要特征，具有高度发病率和死亡率，给养鹅业带来了很大的损失。国内外学者先后建立了琼脂扩散试验、中和试验、血凝抑制试验等血清学诊断方法，在一定程度上为防治鹅副粘病毒病发挥了重要作用，但同时也存在灵敏度差、操作烦琐、检测所需时间长等不足，已不适应更有效地控制该病的需要。本论文将鹅副粘病毒NP基因的重组质粒pGEX-6P-NP转化到工程菌BL21(DE3)pLysS内，重组NP蛋白在大肠杆菌中获得了表达，并且进行了切胶纯化。用表达的融合蛋白作为包被抗原，以灭活油苗免疫制得的鹅血清做为一抗，HRP标记的兔抗鹅血清作为二抗，并确定了ELISA最佳工作条件，即抗原包被浓度为54μg／ml，4℃包被过夜，血清(1：800)和酶标兔抗鹅(1：1500)分别在37℃1h，底物溶液37℃显色20min。对各项条件和参数进行了优化，为开发标准化诊断试剂盒奠定了坚实的基础。通过对检测抗原的交叉试验及阻断试验均证明，检测抗原只与抗GPMV抗体发生特异性结合。健康非免疫鹅血清及SPF鸡血清的检测均出现阴性结果。鸡胚尿囊液中的GPMV可阻断检测抗原与相应阳性血清的结合，证明该检测抗原的特异性是可靠的。所建立的方法重复性好、特异性强、灵敏度高。可用于GPMV流行病学的调查和GPMV灭活苗免疫后血清抗体水平的检测。

全文目录

中文摘要  8-9
英文摘要  9-10
1 引言  10-20
  1.1 鹅副粘病毒病研究进展  10-12
    1.1.1 鹅副粘病毒病的概述  10
    1.1.2 临床证状  10-11
    1.1.3 主要病理学特征  11
    1.1.4 鹅副粘病毒的分子生物学研究进展  11-12
  1.2 GPMV的分子生物学特征  12-16
    1.2.1 GPMV基因组结构  12-13
    1.2.2 GPMV编码的蛋白及其分子生物学特征  13-16
  1.3 鹅副粘病毒血清学检测方法  16-18
    1.3.1 血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)  16-17
    1.3.2 琼脂扩散试验(AGP)  17
    1.3.3 荧光抗体技术(FA)  17
    1.3.4 单抗介导的ELISA  17-18
    1.3.5 血清中和试验  18
    1.3.6 分子生物学诊断方法的研究  18
  1.4 研究的目的与意义  18-20
2 材料与方法  20-24
  2.1 实验材料  20
    2.1.1 质粒  20
    2.1.2 病毒及实验动物  20
    2.1.3 酶及主要试剂  20
    2.1.4 主要实验仪器与设备  20
  2.2 实验方法  20-24
    2.2.1 GPMV增殖与初步纯化  20
    2.2.2 GPMV灭活苗的制备  20-21
    2.2.3 GPMV阳性血清的制备  21
    2.2.4 pGE-NP的原核表达  21
    2.2.5 重组NP蛋白SDS-PAGE电泳及Western Blotting分析  21
    2.2.6 重组NP蛋白的纯化及Western Blotting分析  21-22
    2.2.7 重组 NP蛋白浓度的测定及保存  22
    2.2.8 GPMV重组 NP蛋白间接 ELISA方法的建立  22-24
3 结果与分析  24-30
  3.1 NP基因的表达、纯化及鉴定  24-26
    3.1.1 重组表达载体pGEX-6P-NP的酶切鉴定  24
    3.1.2 重组原核表达NP蛋白的SDS-PAGE分析  24-25
    3.1.3 重组原核表达蛋白的Western-blot分析  25-26
  3.2 GPMV重组 NP蛋白间接 ELISA方法的建立  26-28
    3.2.1 抗原最佳包被浓度及待检血清最佳稀释度的选择  26
    3.2.2 二抗最佳稀释度的选择  26-27
    3.2.3 间接 ELISA最佳反应条件的确定  27-28
  3.3 临界值的确定  28
  3.4 GPMV重组 NP蛋白间接 ELISA体系评价  28-30
    3.4.1 特异性试验  28-29
    3.4.2 敏感性试验  29
    3.4.3 重复试验  29-30
4 讨论  30-34
  4.1 核衣壳蛋白(NP)基因  30
  4.2 重组 NP蛋白的原核表达  30-31
  4.3 NP蛋白表达条件的优化  31
  4.4 NP蛋白的纯化及鉴定  31
  4.5 GPMV检测方法的应用及分析  31-32
  4.6 ELISA方法的建立  32-34
    4.6.1 固相载体及包被条件的影响  32
    4.6.2 包被浓度的影响  32-33
    4.6.3 血清浓度的影响  33
    4.6.4 封闭液的选择  33
    4.6.5 显色  33-34
5 结论  34-35
致谢  35-36
参考文献  36-40
攻读硕士学位期间发表的论文  40

以重组NP为抗原GPMV抗体间接ELISA检测方法的建立

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