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EIAV中国疫苗株诱导的体外超感染抵制以及TLR3在其中作用的研究

作　者: 王珊珊
导　师: 周建华
学　校: 中国农业科学院
专　业: 兽医
关键词: EIAV 弱毒疫苗超感染抵制天然免疫 Toll样受体
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus,EIAV）是感染马属动物的慢病毒。EIAV中国弱毒疫苗株，是可诱导针对同源或异质EIAV毒株的良好免疫保护，并唯一被成功大规模应用的慢病毒疫苗。以该弱毒疫苗系统作为慢病毒疫苗的研究模型，明确其致弱和诱导免疫保护的机制，将对慢病毒免疫机制研究和有效疫苗研制提供参考，因而具有重要的理论意义和应用价值。本文选择EIAV中国驴胎皮肤细胞适应性弱毒疫苗株EIAVFDDV13作为研究对象，对该弱毒疫苗诱导的超感染抵制（Super-infection resistance, SIR）现象及其与固有免疫激活间的相关性等问题进行了探讨。SIR是指一种病毒感染宿主细胞后，可以诱导细胞产生抵抗相同和近似病毒超感染的能力。包括人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）和EIAV在内的慢病毒可诱导SIR。我们使用EIAV中国疫苗弱毒株EIAVFDDV13和具有致病力的EIAV感染性克隆毒株EIAVUK3作为慢病毒的弱、强毒株的模式毒株，就二者在诱导SIR能力上是否存在差异进行了比较研究。基于可特异性区分强、弱毒株的病毒实时荧光定量PCR（Real-time qPCR）和病毒RNA原位杂交技术（ViewRNA）证实，EIAVFDDV13体外感染马单核细胞由来的巨噬细胞（Equine monocyte derivedmacrophage，eMDM）后诱导的针对EIAVUK3株的SIR，明显强于EIAVUK3诱导的针对EIAVFDDV13的SIR。基于分支链DNA检测技术（Branch DNA）进一步证实, EIAVFDDV13感染MDM后，相对于EIAVUK3感染组，其上调了细胞内Toll-like receptor（TLR）3、INFβ、Trim5α和Tetherin等分子的表达。这些分子可通过不同机制，对EIAV在eMDM内的感染和复制过程产生抑制作用。通过适量寡核苷酸Poly I:C刺激，激活eMDM内的TLR3信号通路，可在该细胞中模拟出近似于EIAVFDDV13感染后eMDM细胞内上述分子的表达水平，且该状态的细胞获得了抵抗EIAV感染的能力。通过向eMDM中转染TLR3特异的siRNA，可抑制该细胞中TLR3mRNA的表达，而TLR3基因表达受抑制的eMDM，经Poly I:C作用后其TLR3mRNA的表达未见明显上调。同时，处于该状态的eMDM相对于单纯Poly I:C刺激组，对EIAV感染的抵抗能力也出现明显降低。基于以上研究结果，我们推测TLR3通路的激活，在EIAVFDDV13诱导的SIR中发挥重要作用。本论文获得的上述研究结果，将促进我们对EIAV中国弱毒疫苗株生物学特性的更多了解。同时，对该疫苗株诱导保护性免疫机制的探讨，也将为设计可诱导保护性免疫的慢病毒疫苗提供参考。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-14
第一章引言  14-23
  1.1 马传染性贫血病毒概述  14-17
    1.1.1 EIAV 的形态结构  14-15
    1.1.2 EIAV 的基因组构成  15
    1.1.3 EIAV 受体研究  15-16
    1.1.4 EIAV 弱毒疫苗株的研制路线  16
    1.1.5 中国 EIAV 弱毒疫苗免疫指标检测平台的建立  16-17
  1.2 病毒干扰现象研究进展  17-18
  1.3 抗病毒感染的固有免疫  18-19
    1.3.1 重要的固有免疫受体——TLRs  18-19
    1.3.2 重要的抗病毒固有免疫分子及其作用机制  19
  1.4 Branch DNA 的信号放大技术原理与应用  19-21
    1.4.1 QuantiGene ViewRNA 技术原理与应用  20
    1.4.2 QuantiGene Plex2.0 技术原理与应用  20-21
  1.5 本研究的目的及意义  21-23
第二章材料与方法  23-30
  2.1 材料  23-24
    2.1.1 细胞和毒株  23
    2.1.2 质粒及菌株  23
    2.1.3 主要试剂及仪器  23
    2.1.4 网络资源  23-24
  2.2 方法  24-30
    2.2.1 检测 EIAV 感染的 ViewRNA 试验  24-25
    2.2.2 Real-time PCR 试验检测病毒超感染抵制现象  25-26
    2.2.3 EIAVFDDV13和 EIAVUK3在宿主细胞 MDM 上的诱导细胞凋亡的差异性分析  26-27
    2.2.4 基于 Branch-DNA 技术对细胞内多种分子 mRNA 表达的检测  27-28
    2.2.5 Poly I:C 处理细胞和 EIAV 的感染  28
    2.2.6 TLR3 对病毒感染的影响  28-29
    2.2.7 统计学分析  29-30
第三章结果  30-41
  3.1 检测 EIAV 感染的 ViewRNA 试验结果  30-32
    3.1.1 ViewRNA 试验的优化  30
    3.1.2 单探针杂交试验  30
    3.1.3 探针特异性试验  30-31
    3.1.4 EIAV 不同病毒株共感染细胞的原位检测  31-32
  3.2 Real-time PCR 检测病毒干扰现象试验结果  32-34
    3.2.1 检测 EIAVFDDV13和 EIAVUK3的 Real-time PCR 标准曲线的建立  32-33
    3.2.2 EIAVFDDV13和 EIAVUK3在宿主细胞 MDM 上的复制特性比较  33
    3.2.3 EIAVFDDV13和 EIAVUK3在MDM上诱导的SIR  33-34
  3.3 EIAVFDDV13和 EIAVUK3在宿主细胞 MDM 上的诱导细胞凋亡的差异性分析  34-35
  3.4 MDM 后诱导的细胞内多种分子 mRNA 表达差异性分析  35-37
    3.4.1 EIAV 细胞受体 ELR1 的表达差异  35
    3.4.2 TLR3、7、8、9 的表达差异分析  35-36
    3.4.3 I 型干扰素的表达差异分析  36-37
    3.4.4 抗病毒固有免疫分子 A3Z3、TRIM5a、SAMHD1 和 Tetherin 的表达差异分析  37
  3.5 TLR3 的激活对 EIAV 感染 MDM 的影响  37-39
  3.6 TLR3 基因的沉默对 EIAV 感染 MDM 的影响  39-41
    3.6.1 siRNA 转染条件的优化结果  39
    3.6.2 转染 siRNA 的 MDM 细胞不能抑制病毒的感染  39-41
第四章讨论  41-44
第五章全文结论  44-45
参考文献  45-53
致谢  53-54
作者简介  54

EIAV中国疫苗株诱导的体外超感染抵制以及TLR3在其中作用的研究

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