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重组H5N2亚型禽流感病毒株的构建及其免疫原性的初步研究

作　者: 杨禹
导　师: 李一经
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 禽流感病毒 反向遗传操作系统 生物学特性 转染 标记疫苗
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


禽流感（Al）是由A型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染病。目前世界上预防禽流感最为广泛的疫苗是全病毒油乳剂灭活苗，但是这种疫苗严重影响了病毒的监测和流行病学调查，为了控制流行的H5N1亚型高致病性禽流感病毒和研制具有标记的疫苗，本实验做了以下几方面的研究：重组流感病毒（rgH5N2/PR8）的拯救、rgH5N2/PR8生物学特性研究、“标记”灭活疫苗对SPF鸡的免疫效力、流行野毒A/Chicken/SD/2010（H5N1）NA抗体的检测等四方面的内容。（1）重组流感病毒（rgH5N2/PR8）的拯救。本实验用流行的H5N1亚型AIV的HA基因和H9N2亚型AIV的NA基因及H1N1亚型IV（A/PR/8/34毒株）的6个内部基因通过流感8质粒反向遗传操作系统拯救了重组病毒rgH5N2/PR8株，为了降低重组病毒的毒力，对H5N1亚型AIV的HA基因进行了修饰，使其裂解模式由PLRERRRKR↓GL修饰为PLIETR↓GL。采用lipofectin2000（Invitrogen）转染试剂法转染293T细胞（人胚胎肾细胞），转染后的细胞接种9～10日龄SPF鸡胚繁毒，经血凝实验检测其活性后测序。结果表明，拯救病毒的基因组完全来源于重组质粒。（2）rgH5N2/PR8生物学特性。将获得的rgH5N2/PR8株在9～10日龄SPF鸡胚上连续传10代。该重组病毒的血凝效价稳定在1:2048，其半数感染量(EID50)可达10-8.77/0.1ml。该病毒的毒力显著降低，对鸡胚的ELD50为10-5/0.1ml。（3）“标记”灭活疫苗对SPF鸡的免疫效力。将rgH5N2/PR8用甲醛灭活，并与油佐剂乳化，制成灭活疫苗。给6周龄SFP鸡接种不同剂量，接种21天后，用106EID50剂量的H5N1野毒A/Chicken/SD/2010（H5N1）进行鼻腔攻击，结果为，接种剂量0.1ml/只的试验组可获得50%的保护，接种0.3ml/只的试验组可获得100%保护。结果表明，该疫苗具有很好的免疫效力。（4）流行野毒A/Chicken/SD/2010（H5N1）NA抗体的检测。为了确定接种了“标记”灭活疫苗的SPF鸡是否感染流行野毒A/Chicken/SD/2010（H5N1），通过间接免疫荧光试验检测其NA抗体。方法大致如下：将处于对数增长期的Sf9细胞按1×106个细胞/孔接种于6孔板中，放入27℃培养箱中培养至50%～60%丰度，将滴度确定的重组杆状病毒以15μl/孔接种细胞，培养至120h后取出进行间接免疫荧光试验。统计结果显示，免疫组（共30只鸡）的鸡群在接受野毒A/Chicken/SD/02/08（H5N1）攻击后有25只鸡NA-IFA检测为阳性，细胞表面出现了黄绿色荧光，说明感染了野毒，体内除产生了N2抗体外还产生了N1抗体；另外有5只鸡经NA-IFA检测为阴性，细胞表面未出现黄绿色荧光，说明疫苗产生的抗体滴度高，阻止了强毒在体内的复制，其体内只产生了N2抗体。以上结果表明疫苗免疫不能完全阻止病毒的感染，但能防止出现临床症状。说明该方法能够区分rgH5N2/PR8标记疫苗产生的抗体和自然感染H5N1亚型禽流感病毒产生的抗体，从而能够鉴别出接种了疫苗的鸡是否感染了H5N1亚型禽流感病毒，为在免疫禽群净化H5N1亚型禽流感病毒提供一种可行的技术手段。综上，本实验获得的重组病毒株rgH5N2/PR8具有疫苗标记、繁殖滴度高、毒力低、免疫原性好等特点，可作为“标记疫苗”候选株。

全文目录


目录  4-6
CONTENTS  6-8
摘要  8-9
Abstract  9-11
1 前言  11-19
  1.1 禽流感病毒概述  11-13
  1.2 禽流感流行情况  13-17
  1.3 禽流感疫苗研究进展  17-18
  1.4 研究的目的意义  18-19
2 材料与方法  19-26
  2.1 试验材料  19-20
    2.1.1 细胞株、毒种、菌种  19
    2.1.2 病毒核酸物质  19
    2.1.3 质粒的重排组合  19
    2.1.4 SPF 鸡胚和 SPF 鸡  19
    2.1.5 抗体制剂  19
    2.1.6 试剂  19
    2.1.7 实验主要仪器设备  19-20
  2.2 试验方法  20-26
    2.2.1 大肠杆菌 DH5α 感受态细胞的制备  20
    2.2.2 质粒的转化  20
    2.2.3 重组质粒的克隆  20
    2.2.4 去内毒素质粒的提取  20-21
    2.2.5 H5N1 重组流感病毒的拯救  21
    2.2.6 分子致弱的禽流感 H5N2 亚型标记疫苗株 rgH5N2/PR8 的拯救  21-22
    2.2.7 H5N2 重组病毒鉴定  22-24
    2.2.8 H5N2 重组病毒生物学特性  24
    2.2.9 H5N2/PR8-5B19 疫苗的制备  24-25
    2.2.10 H5N2/PR8-5B19 疫苗免疫保护性实验  25
    2.2.11 检测 H5N1 亚型禽流感病毒 NA 蛋白抗体间接免疫荧光（N1-IFA）方法的应用  25-26
3 结果与分析  26-31
  3.1 重组质粒的鉴定  26
  3.2 转染质粒的浓度测量结果  26
  3.3 重组病毒(rgH5N2/PR8)的拯救  26-27
  3.4 H5N1 重组病毒的活性检测  27
  3.5 野毒株 A/duck/SD/china/02/08(H5N1)的 ELD50测定  27
  3.6 H5N2 重组病毒鉴定  27
    3.6.1 血凝试验(HA)  27
    3.6.2 重组病毒的序列测定  27
  3.7 H5N2 重组病毒生物学特性  27-29
    3.7.1 不同代次重组病毒 HA 效价和 EID50的测定  27-28
    3.7.2 rgH5N2/PR8 的 HA 和 NA 的 RT-PCR 扩增结果  28
    3.7.3 病毒的稳定性检测  28
    3.7.4 重组病毒的 ELD50测定  28-29
  3.8 rgH5N2/PR8 免疫原性及免疫保护性试验  29
    3.8.1 灭活检测结果  29
    3.8.2 HI 抗体测定  29
    3.8.3 攻毒保护试验  29
  3.9 N1-IFA 鉴别诊断的结果  29-31
4 讨论  31-34
  4.1 rgH5N2/PR8 的组成特性  31-32
  4.2 N1-IFA 检测方法的可行性研究  32
  4.3 禽流感标记疫苗的应用前景  32-34
5 结论  34-35
致谢  35-36
参考文献  36-40
附录  40-41
攻读硕士学位期间发表的论文  41

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医传染病学 > 病毒病
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