学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

喹赛多药理与毒理活性成分筛选研究

作　者: 孙启亮
导　师: 袁宗辉
学　校: 华中农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 喹赛多代谢物活性成分 Akt FOXO1 p53 cyclin D1
分类号: S816.75
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 1次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

喹赛多作为一种新型的饲料添加剂具有良好的促生长作用,与喹噁啉类其它药物相比,喹赛多毒性作用很低。喹赛多在体内可被代谢成多种化合物,其中主要代谢物有cy1、cy4、cy6、cy12。迄今为止,仍然不明确喹赛多与代谢物的活性大小。所以有必要对喹赛多及其代谢物的活性大小进行比较,进而筛选出活性化合物,这对理解喹赛多的药理与毒理作用机理具有重要的意义。药物活性化合物筛选指标的选择成为实验的关键,通过文献调研并结合本实验室对喹赛多的实际研究进展情况,最终确定以EGF mRNA的表达作为喹赛多药理活性成分筛选的指标；以化合物与细胞孵育后对细胞活力的影响作为喹赛多毒理活性成分的指标。1喹赛多的药理活性成分筛选采用RT-qPCR技术,首先测定不同浓度的喹赛多与细胞孵育不同时间后EGF的表达,以筛选出喹赛多与细胞作用后EGF mRNA上调表达的最佳浓度与时间点。结果显示,2μM喹赛多与细胞孵育1h后EGF mRNA的表达量与空白组相比上调2倍。喹赛多代谢物与细胞孵育后EGF mRNA上调倍数不如喹赛多显著,在所有代谢物中cy12对EGF的上调作用最明显,达到了1.3倍,cy6其次,cyl最低。所以得出喹赛多及其代谢物药理活性大小顺序为：喹赛多、cy12、cy6、cy4、cy1。加入PI3K和Akt抑制剂后,EGF mRNA表达量有所下调,这说明EGF mRNA的表达受PI3K-Akt调控。与PI3K相比,Akt对EGF mRNA表达的影响更显著。2μM喹赛多可上调FOXPO1和p53的表达,但上调倍数不明显。当Akt受抑制后,FOXO1的表达显著上调,同时p53表达显著下调；当PI3K受抑制后FOXO1和p53表达变化均没有抑制Akt后的变化显著,这提示喹赛多激活的是Akt而不是PI3K。当加入ROS清除剂NAC后,喹赛多并不能使FOXO1和p53的表达发生显著变化,这提示喹赛多可能通过代谢产生ROS从而激活Akt,喹赛多及其代谢物与细胞孵育后对Akt磷酸化水平测定结果显示,喹赛多与其代谢物相比可明显促进p-Akt的表达。构效关系分析显示,喹赛多N-O基团是喹赛多的活性基团,N-O基团的代谢决定着喹赛多的活性。N-O基团的代谢促进细胞ROS的产生,2μM喹赛多与细胞孵育后,ROS在15min左右即开始释放增加,在60min左右释放量达到最高。对细胞周期相关蛋白cyclin D1进行荧光定量测定显示,喹赛多在2h左右即可引起cyclin D1表达上调,在8h左右上调倍数达到最大,western blot检测结果显示cyclin D1在8h和12h表达量明显升高。由以上结果我们推测,喹赛多可代谢产生ROS激活Akt,上调EGF的表达,促进细胞分裂周期相关蛋白的表达,从而促进细胞增殖,达到促生长效果。2喹赛多毒理活性成分筛选MTT实验与LDH释放检测实验结果显示,100μM喹赛多及其代谢物均可产生较明显的细胞毒性,喹赛多的细胞毒性明显高于代谢物,以细胞毒性大小为指标确定喹赛多及其代谢物毒性大小顺序为：喹赛多、cy12、cy4、cy6、cy1,这提示喹赛多经代谢后毒性降低。荧光定量结果显示,EGF、FOXO1和p53的表达呈现很明显的量效关系,EGF和FOXO1的表达随着喹赛多浓度的增加而下降；p53的表达随着喹赛多浓度的增加而上升。当Akt被抑制后,p53的表达显著下调,FOXO1表达与空白组相比无明显变化；当PI3K被抑制后,p53和FOXO1的变化没有Akt抑制后的变化显著。这提示毒理浓度下喹赛多使Akt而不是PI3K被过度激活,western blot检测结果显示,喹赛多与Akt抑制剂共同孵育后,细胞p-Akt水平较高。毒理浓度下细胞ROS释放测定结果显示,喹赛多与其代谢物相比能明显促进细胞ROS产生,20gM喹赛多即可显著促进ROS释放,且量效关系明显。时效关系测定显示,ROS释放量随着孵育时间的延长而升高,在90min时ROS释放量达到最高,100gM喹赛多与其代谢物相比可明显促进细胞凋亡综上所述,本研究选用了合适的指标,分析了筛选指标的时效量效关系,比较了喹赛多及其代谢物的活性大小,最终确定N-O基团是喹赛多的活性基团,喹赛多的药理与毒理活性高于代谢物,喹赛多代谢产生ROS剂量大小决定喹赛多活性,低剂量喹赛多浓度下,喹赛多代谢产生少量ROS, Akt被轻微激活,细胞氧化磷酸化作用加快,细胞分裂加快,喹赛多表现出促生长效应；高剂量喹赛多浓度下,喹赛多代谢产生大量ROS, Akt被过度激活,过度激活的Akt一方面使细胞线粒体负荷加重促使细胞产生更多ROS,另一方面ROS激活p53通路,促使细胞凋亡。由此可以确定喹赛多药理与毒理活性是使细胞释放不同剂量的ROS从而使细胞呈现出不同的反应。

全文目录

摘要  8-11
Abstract  11-14
缩略词表  14-16
1 前言  16-27
  1.1 研究背景  16-24
    1.1.1 喹赛多药理与毒理作用机制研究进展  16-22
    1.1.2 细胞模型用于药物筛选的研究进展  22-24
  1.2 研究内容  24-25
  1.3 研究思路  25-26
  1.4 研究意义  26-27
2 材料和方法  27-44
  2.1 细胞株  27
  2.2 药品和试剂  27-30
  2.3 主要仪器和设备  30-31
  2.4 溶液配制  31-33
  2.5 细胞的复苏、传代和冻存  33-34
  2.6 总RNA的提取  34
  2.7 总RNA纯度及完整性的检测  34
  2.8 反转录反应  34-35
  2.9 实时荧光定量PCR检测目的基因mRNA表达水平  35-37
  2.10 Western Blot实验  37-40
    2.10.1 细胞蛋白提取及蛋白浓度测定  37
    2.10.2 SDS-PAGE电泳  37-39
    2.10.3 Western blot  39-40
  2.11 细胞活力的检测  40-43
    2.11.1 MTT法检测喹嗯啉类代谢物对L02细胞的活力影响  40-41
    2.11.2 乳酸脱氢酶(LDH)释放测定  41-42
    2.11.3 细胞内自由基(ROS)释放测定  42
    2.11.4 细胞凋亡的检测  42-43
  2.12 统计学分析  43-44
3 结果  44-60
  3.1 总RNA质量  44
  3.2 喹赛多及其代谢物对EGF基因表达的时效量效关系  44-47
    3.2.1 喹赛多对EGF基因表达的时效量效关系分析  44-45
    3.2.2 喹赛多的主要代谢物对EGF mRNA表达的影响  45-46
    3.2.3 PI3K-Akt通路对EGF表达的调控  46-47
  3.3 2μM喹赛多与细胞孵育后对ROS释放的影响  47-48
  3.4 2gM喹赛多对FOXO1和P53 mRNA和蛋白表达的影响  48-50
  3.5 2gM喹赛多对cyclin D1表达的影响  50-51
  3.6 喹赛多及其代谢物对L02细胞剂量及时间依赖性毒性作用  51-52
  3.7 喹嗯啉类代谢物对L02细胞中LDH释放的影响  52-53
  3.8 喹赛多及其代谢物对ROS释放的影响  53-54
  3.9 100μM喹赛多对FOXO1和P53表达的影响  54-57
  3.10 喹赛多与EGF和FOXO1及p53表达的量效关系  57-58
  3.11 100MM喹赛多对细胞凋亡的影响  58-60
4 讨论  60-67
  4.1 喹赛多及其代谢物药理与毒理活性大小  60
  4.2 喹赛多促进ROS释放的时效量效及与Akt激活间的关系  60-64
  4.3 P53表达的量效关系以及p53表达和Akt激活间的关系  64-65
  4.4 FOXO1的量效关系以及FOXO1与Akt激活之间的关系  65-66
  4.5 喹赛多的药理与毒理作用机理  66-67
5 全文总结  67-68
6 文献综述  68-79
参考文献  79-92
致谢  92-94
附录  94-100
  附录Ⅰ---研究生简介  94
  附录Ⅱ--实时荧光PCR各基因扩增产物的溶解曲线分析结果  94-95
  附录Ⅲ-实验过程中细胞培养的步骤  95-96
  附录Ⅳ-实验过程中RNA的提取步骤  96-97
  附录Ⅴ-BCA标曲的测定  97-98
  对各答辩委员的答复书  98-100

喹赛多药理与毒理活性成分筛选研究

内容摘要

全文目录

相似论文