学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

白桦雄花突变体差异表达基因cDNA-AFLP分析

作　者: 刘瀛
导　师: 刘雪梅
学　校: 东北林业大学
专　业: 遗传学
关键词: 白桦突变体 cDNA-AFLP 雄性不育转录表达
分类号: S792.153
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 106次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

白桦(Betula platyphylla Suk.),是雌雄同株的单性花树种,在园林绿化,建筑材料,餐饮业及医药业等方面具有一定的应用价值。在我们先前的研究中已经发现了天然的雄花序突变体,其结构和生殖发育均不同于正常雄花序,显示出明显的雄性不育特征。为了揭示该雄花突变体的发育机理,本文应用cDNA-AFLP分子标记技术,分别对白桦发育早、晚期突变雄花序(M)和类似正常雄花序(NL)进行差异表达基因的筛选。将获得的差异片段进行BlastX同源性比对和初步的生物信息学分析。根据序列的生物功能,从中选择与白桦花发育有关的差异序列进行实时定量PCR的检测,检测它们在白桦雄花突变植株的不同组织及雄花发育不同阶段中的表达情况,并对其基因功能进行初步分析。利用I2-KI和过氧化物酶的方法对白桦雄花花粉活性进行检测。实验结果表明,白桦突变雄花花粉生活力较正常水平呈明显的降低,推测其育性能力可能发生了改变。在白桦雄花突变体早期发育的cDNA-AFLP分析中得到约4500个多态性片段(TDFs),其中有280个为差异表达片段,回收后得到81个TDFs,提交到GenBank数据库(收录号为JK546624-JK546704)。通过对81个TDFs进行BlastX同源性比对,有51个TDFs与GenBank中的基因相似性较低或无匹配,被视为新基因,其余30个TDFs与已知蛋白具有较高的同源性(BlastX E-Value<e-10)。将这30个序列进行GO生物功能和KEGG生物代谢途径的分析,结果表明,这些蛋白参与催化活性,结合活性,生物调节信号转导,生物合成以及基因编码转录因子和花发育等过程。另外,选择5个与白桦花发育有关的TDFs (MAP激酶、泛素结合酶、纤维素合成酶、热激蛋白和细胞色素P450),应用Realtime RT-PCR检测它们在白桦雄花突变植株的不同组织和雄花发育过程的转录表达情况,初步推测它们在突变雄花早期发育中的作用。在白桦雄花突变体晚期发育的差异基因表达谱中,实验共获得约5000个cDNA片段,其中有323个为差异表达片段。成功测序共得到141个TDFs,提交到数据库中生成序列号(JK546705-JK546845)并进行BlastX同源性比对,其中88个TDFs与已知的蛋白质或其它植物的报道序列有显著的同源性(BlastX E-Value<e-10),余下的53个TDFs无匹配为新基因。将88个具有同源性的序列进行GO分类和KEGG生物信息学分析,这些蛋白涉及信号转导,蛋白转运,应激反应,能量代谢,转录等过程。从已知功能的差异片段中,选择了10个与花发育相关的TDFs通过Realtime RT-PCR来确定它们在不同的组织的表达水平,推测其在突变雄花晚期发育的过程中发挥的作用。将白桦突变雄花早期发育和晚期发育差异基因的表达情况进行分析比较,在两时期中除了那些通常为高表达的生物过程(例如,代谢过程、细胞过程、发育过程、生物合成过程、生物调节过程和刺激反应过程)存在外,还发现在突变雄花发育的早、晚时期中分别存在特定的表达,这些差异基因及其生物信息的获得为今后进一步揭示白桦雄花发育及雄性不育机理奠定了基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
1 绪论  11-17
  1.1 高等植物花发育研究进展  11-12
    1.1.1 高等植物花发育分子遗传学的研究  11
    1.1.2 控制植物花器官发育的ABCDE模型  11
    1.1.3 高等植物花发育基因的研究  11-12
  1.2 木本植物花发育基因的研究  12
  1.3 白桦花发育的研究进展  12-13
    1.3.1 白桦概况  12-13
    1.3.2 白桦花发育基因的研究  13
  1.4 利用突变体进行基因功能的研究  13-14
  1.5 cDNA-AFLP技术及表达研究中的应用  14-15
    1.5.1 cDNA-AFLP技术的原理及方法  14
    1.5.2 cDNA-AFLP技术的优缺点  14-15
    1.5.3 cDNA-AFLP技术的应用  15
  1.6 研究的目的、意义和内容  15-17
    1.6.1 研究的目的及意义  15-16
    1.6.2 实验研究内容  16-17
2 白桦雄花花粉活力的测定  17-22
  2.1 实验材料  17
  2.2 试剂及实验设备  17
    2.2.1 试剂  17
    2.2.2 仪器设备  17
  2.3 实验方法  17-18
    2.3.1 I_2-KI染色法测定  17-18
    2.3.2 过氧化物酶化法  18
  2.4 结果与分析  18-20
    2.4.1 I_2-KI染色法对花粉活性的测定  18-19
    2.4.2 过氧化物酶化法花粉活性的检测  19-20
  2.5 讨论  20-21
  2.6 本章小结  21-22
3 白桦雄花突变体早期发育差异表达基因的cDNA-AFLP分析  22-49
  3.1 实验材料  22
    3.1.1 白桦雄花突变体早期发育cDNA-AFLP分析的材料  22
    3.1.2 白桦雄花突变体差异基因表达分析的材料  22
  3.2 试剂及实验设备  22-24
    3.2.1 酶及试剂  22
    3.2.2 其它试剂  22-24
    3.2.3 仪器设备  24
  3.3 实验方法  24-35
    3.3.1 核酸的提取和纯化  24-25
    3.3.2 双链cDNA的合成  25-27
    3.3.3 cDNA-AFLP分析  27-30
    3.3.4 差异片段的回收、克隆和测序  30-33
    3.3.5 差异片段的生物信息学分析  33
    3.3.6 白桦雄花突变体早期发育5个相关基因的表达分析  33-35
  3.4 结果与分析  35-47
    3.4.1 总RNA的提取与纯化  35
    3.4.2 预扩增  35-36
    3.4.3 选择性扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析  36-37
    3.4.4 差异片段的选择  37
    3.4.5 差异片段的回收、克隆和测序  37
    3.4.6 差异表达基因的测序结果及功能分析  37-44
    3.4.7 差异表达TDFs的检测  44
    3.4.8 白桦雄花突变体早期发育相关基因的表达分析  44-47
  3.5 讨论  47-48
    3.5.1 差异片段的生物学意义  47
    3.5.2 花发育相关基因的表达分析  47-48
  3.6 本章小结  48-49
4 白桦雄花突变体晚期发育差异表达基因的cDNA-AFLP分析  49-69
  4.1 实验材料  49
    4.1.1 白桦雄花突变体晚期发育cDNA-AFLP分析的材料  49
    4.1.2 白桦雄花突变体晚期差异基因表达分析的材料  49
  4.2 试剂及实验设备  49
  4.3 实验方法  49-51
    4.3.1 核酸的提取和纯化  49
    4.3.2 双链cDNA的合成  49
    4.3.3 cDNA-AFLP分析  49
    4.3.4 差异片段的回收、克隆和测序  49
    4.3.5 差异片段的生物信息学分析  49
    4.3.6 白桦雄花突变体早期发育10个相关基因的表达分析  49-51
  4.4 结果与分析  51-66
    4.4.1 总RNA的提取和纯化  51-52
    4.4.2 预扩增  52
    4.4.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析  52-53
    4.4.4 差异表达基因的功能分析  53-63
    4.4.5 白桦雄花突变体晚期发育相关基因的表达分析  63-66
  4.5 讨论  66-68
    4.5.1 序列TDFs显示与花发育有关  66
    4.5.2 花发育相关基因的表达分析  66-68
  4.6 本章小结  68-69
5 白桦突变体发育早期和晚期的比较  69-71
结论  71-72
参考文献  72-80
攻读学位期间发表的学术论文  80-81
致谢  81-82

白桦雄花突变体差异表达基因cDNA-AFLP分析

内容摘要

全文目录

相似论文