学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

烟草抗马铃薯γ病毒（PVY）育种、抗性基因的克隆与功能分析

作　者: 陈荣平
导　师: 杨铁钊
学　校: 河南农业大学
专　业: 烟草学
关键词: 烟草马铃薯Y病毒(PVY) 抗PVY的烟草品种抗性基因抑制性消减杂交 eIf4E
分类号: S572
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
下　载: 118次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)是我国烟叶生产中的主要病害之一,近年来，随着农村保护地蔬菜栽培和马铃薯种植面积的扩大，烟草PVY病毒病的发生与危害呈现急剧上升趋势，在黑龙江、吉林、辽宁、山东、安徽和云南相继出现大面积爆发流行，造成了严重的经济损失。针对我国烟区缺乏抗PVY品种的生产实际，本研究通过筛选烟草PVY抗源，并对主要抗源材料进行抗性遗传分析，克隆其抗性基因，同时开展抗PVY烟草育种工作,主要包括以下内容:1.采用人工接种方式，在温室和田间病圃中分别对17份和114份烟草种质进行PVY抗病性鉴定，筛选出高抗马铃薯Y病毒的烟草种质资源C151、CV91，达到中抗水平的有CV87，87414和NC55,表现多基因水平抗性。2.对C151、CV91、CV87和NC55等抗源材料进行了抗性遗传分析，证实C151为少数基因控制，不完全显性，CV91为少数隐性基因控制，易受显性感病基因影响，与没有显性感病基因品种杂交表现抗性。CV87分别与IslandGold和龙江851杂交组合的F2代抗感比例不同且表现连续分布，证实为多数微效基因控制，且为加性基因控制。NC55×9625组合F2代中无病株-病轻株-病重株≈8-5-3，基本表现连续分布，NC55是多数微效抗性基因。3.利用高抗PVY的CV91做亲本，选育出了烤烟常规纯系品种龙江911和杂种优势利用品种LJ237，其中龙江911为中抗马铃薯Y病毒病，LJ237高抗马铃薯Y病毒病，利用CV87育成了抗马铃薯Y病毒的烤烟品种LJ981。4.提出微效水平抗性基因富集思路，利用中等水平抗性资源,选配适当的杂交组合，在杂交后代材料中富集、浓缩抗性基因，得到高于抗性亲本抗性的品种，重视水平抗性资源的开发与利用。5.以高抗PVY的C151为试验材料，利用抑制差减杂交技术（Suppression SubtractiveHybridization，SSH）构建了抗PVY相关基因的烟草叶片SSH文库，对烟草叶片接种PVY前后的差异表达基因片段进行测序，得到280多条EST序列。利用NCBI上的GenBank等公共数据库对所获得的280多条EST序列进行生物信息分析和功能预测，其中与光合作用有关的RuBP羧化酶相关蛋白基因片段96条，林烟草和绒毛烟草叶绿体DNA片段12条，与抗病性有关的有：脂质转化酶基因片段15条，突变的过氧化氢酶基因片段8条，蛋白酶抑制剂基因片段32条，铁氧还蛋白和铁硫蛋白基因片段26条，糖基转移酶3条，富含甘氨酸蛋白质前体蛋白9条。其他序列86条，未知基因片段71条。6、利用荧光定量PCR对5个可能与抗病性有关诱导表达片段的从开始接种到接种后72小时之间的0小时，12小时，24小时，36小时和72小时5个时间点基因的差异表达，并证实了所获得的基因序列为真实诱导的表达序列。对此序列进行RACE，最终获得一个与PVY抗病性有关的全长cDNA序列。7、采用同源序列法，根据抗PVY的辣椒品种中的eIF4E基因序列设计扩增引物，在抗PVY的CV91、C151等烟草品种扩增晒选抗性基因，在CV91品种中克隆出了与马铃薯Y病毒抗性有关的翻译起始因子eIF4E基因。8、通过比对该eIF4E基因的核酸序列，发现与感病品种有两个突变位点，导致病毒基因不能翻译，产生抗病性。

全文目录

致谢  4-9
摘要  9-11
1 文献综述  11-38
  1.1 马铃薯 Y 病毒病研究现状  11-15
    1.1.1 马铃薯 Y 病毒的分子生物学研究  11-12
    1.1.2 马铃薯 Y 病毒的株系划分  12-14
    1.1.3 马铃薯 Y 病毒的传播  14-15
  1.2 烟草马铃薯 Y 病毒病的危害与防治  15-18
    1.2.1 烟草马铃薯 Y 病毒病的危害  15-17
    1.2.2 烟草马铃薯 Y 病毒病的防治  17-18
  1.3 烟草抗马铃薯 Y 病毒品种的选育  18-20
    1.3.1 烟草抗马铃薯 Y 病毒种质资源的收集与研究  18
    1.3.2 烟草抗马铃薯 Y 病毒病育种  18-20
  1.4 植物抗病机制研究  20-23
    1.4.1 植物转脂蛋白（lipid transfer protein）研究  21
    1.4.2 RNA 干扰(RNA interference)机制  21-22
    1.4.3 病毒翻译障碍机制  22-23
  1.5 植物抗病基因的种类  23-25
    1.5.1 植物抗病基因分类  23-25
    1.5.2 植物自身的马铃薯 Y 病毒抗性基因  25
  1.6 植物抗病基因的克隆策略  25-29
    1.6.1 功能克隆(functional Cloning)  25-26
    1.6.2 定位克隆(Positional cloning)  26
    1.6.3 人工合成并克隆基因  26
    1.6.4 转座子标记法(transposon tagging)  26-27
    1.6.5 表型克隆(phenotype cloning)  27
    1.6.6 mRNA 差异显示(mRNA differential display)  27-28
    1.6.7 减法杂交(Subtractive hybridization)  28
    1.6.8 依据序列同源性克隆基因  28
    1.6.9 同系位候选法  28-29
  1.7 抑制性消减杂交（suppression subtractive byridization，SSH)技术原理与程序  29-32
  1.8 同源序列克隆的原理与程序  32-36
    1.8.1 全长 cDNA 文库构建  33-35
    1.8.2 RACE  35-36
  1.9 本研究的目的意义  36-38
2 烟草抗马铃薯 Y 病毒种质资源的筛选  38-51
  2.1 试验材料与试验设计  38-42
    2.1.1 试验材料  38-41
    2.1.2 试验设计  41
    2.1.3 调查、统计方法  41-42
  2.2 结果与分析  42-48
    2.2.1 温室接种鉴定结果  42
    2.2.2 田间病圃鉴定结果  42-48
  2.3 结论与讨论  48-51
3 烟草马铃薯 Y 病毒主要抗源材料的抗性遗传分析  51-55
  3.1 试验材料与田间试验设计  51
    3.1.1 试验材料  51
    3.1.2 试验设计  51
  3.2 结果与分析  51-53
  3.3 结论与讨论  53-55
4 烟草抗马铃薯 Y 病毒育种  55-64
  4.1 试验材料  55
  4.2 试验设计与步骤  55-56
  4.3 结果与分析  56-62
    4.3.1 选择抗 PVY 杂交杂交后代材料情况  56-57
    4.3.2 育成抗病品种情况  57-62
  4.4 结论与讨论  62-64
5 烟草 PVY 诱导的抑制性消减文库的建立及 EST 分析  64-87
  5.1 试验材料  64
    5.1.1 供试品种  64
    5.1.2 试验材料的准备  64
  5.2 取样  64
  5.3 耗材试剂  64-66
  5.4 仪器设备  66-67
  5.5 方法  67-69
    5.5.1 总 RNA 的提取  67
    5.5.2 RNA 质量检测  67-69
  5.6 mRNA 分离纯化  69-77
    5.6.1 实验操作步骤  69-71
      5.6.1.1 实验准备  69
      5.6.1.2. 操作  69
      5.6.1.3 合成第一链 cDNA  69-70
      5.6.1.4 合成 cDNA 第二链  70-71
      5.6.1.5 实验参数  71
      5.6.1.6 电泳检测  71
    5.6.2 cDNA RsaI 酶切  71-73
    5.6.3 接头连接  73-74
    5.6.4 差减杂交  74-77
  5.7 实验结果与分析  77-86
    5.7.1 烟叶总 RNA 的提取结果  77-78
    5.7.2 插入片段检测  78
    5.7.3 cDNA 文库构建  78
    5.7.4 EST 处理及文库分析  78-81
    5.7.5 影响文库质量的因素  81-82
    5.7.6 相关抗病基因的分析  82-84
    5.7.7 功能验证  84-86
  5.8 结论与讨论  86-87
6 烟草与 PVY 抗性有关的 eIF(iso)4E 克隆与分析  87-94
  6.1 试验材料  87-88
  6.2 试剂与仪器  88
  6.3 方法  88-89
    6.3.1 引物设计  88
    6.3.2 PCR 扩增体系  88-89
    6.3.3 烟草 DNA 和 RNA 的提取  89
    6.3.4 烟草 eIF4E、eIF(iso)4E 基因 cDNA 的合成及克隆  89
    6.3.5 RACE 克隆全长基因  89
    6.3.6 克隆片段的测序与分析  89
  6.4 结果与分析  89-93
    6.4.1 各品种（系）DNA 筛选结果  89-90
    6.4.2 RNA RT-PCR 扩增产物分析  90-92
    6.4.3 CV91 品种 eIF4E 基因 RACE 克隆产物分析  92-93
  6.5 结论与讨论  93-94
7 论文总结  94-95
参考文献  95-105
Abstract  105-106

烟草抗马铃薯γ病毒（PVY）育种、抗性基因的克隆与功能分析

内容摘要

全文目录

相似论文