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甜菜栽培品种的DNA指纹图谱构建及遗传多样性分析

作　者: 吴则东
导　师: 王华忠
学　校: 中国农业科学院
专　业: 作物遗传育种
关键词: 甜菜品种 DNA快速提取核心引物 SSR标记多重PCR 指纹图谱
分类号: S566.3
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

品种的真实性和纯度是种子检测最重要的指标之一，而研究快速、准确、简便的ＤＮＡ分子标记技术鉴定甜菜种子和将来新品种授权均具有重要的意义。本研究首次利用SSR分子标记对我国生产上应用的甜菜品种进行指纹图谱的构建，同时对影响品种纯度和真实性鉴定的各种因素进行系统的分析，建立了一套快速、高效的品种纯度和真实性鉴定方法，使快速鉴定甜菜品种及不同实验室的交流成为可能。主要结果如下：1.建立了快速高效提取甜菜基因组DNA的方法。本研究使用甜菜干种子或者叶片经真空冷冻干燥机处理1-2天后的干粉为原料，使用96孔PCR板代替单个离心管，利用碱裂解法对两种样品进行DNA的提取，该方法无需使用液氮，提取上百份DNA仅需要20分钟,提取的DNA能够作为SSR-PCR的模板。2．筛选出29对可用于指纹图谱构建的SSR核心引物。利用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对101对甜菜SSR扩增产物进行检测，共找到29对带型清晰、重复性好、多态性高、易于识别的引物，每对引物平均扩增出2～11个等位基因。扩增的片段大小在90～500bp之间，这29对引物可以作为甜菜品种纯度和真实性鉴定的核心引物。3．建立了甜菜多重SSR-PCR扩增体系。在单一SSR～PCR的基础上，甜菜2～3重SSR-PCR的体系为：每增加1重SSR，仅仅增加相应引物的量以及减少相应去离子水的量，其余成分不变。甜菜4～5重SSR-PCR要在单一PCR的基础上增加0.5倍的DNTPs以及相应引物的量，同时根据个别引物扩增效率的不同，相应减少个别引物的用量，此体系对大多数4重和5重PCR有效。多重PCR扩增体系的检测效率是单引物PCR的2～5倍。4.有7对引物可单独进行品种鉴定，利用其中3对引物构建了46个甜菜品种的SSR指纹图谱。聚类分析结果表明，在遗传距离0.20处，所有的品种被分为一类，在遗传距离0.16处，46个品种被分为4个类群，聚类分析结果与材料的来源有很好的一致性，基本上是同一公司或者同一国别的品种聚在了一起，从分子水平上说明了甜菜品种之间的遗传基础狭窄。另外，有7对引物SB04、S7、S6、BVV45、SB13、S13和S8单独使用时能够鉴别不同的品种，利用其中的3对引物SB04、S6和S7构建的指纹图谱就能区别所有的品种。5.建立了一套快速鉴定甜菜品种纯度和真实性的方法。该方法使用96孔PCR板，利用碱裂解法提取干粉DNA；使用GV及λ DNA检测提取样品DNA的浓度和质量； PCR反应体系为10μL；PCR反应程序将循环中的变性和退火温度均改为15s,延伸为30s，35个循环；PCR产物的分离使用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；最后使用快速银染法对电泳后的聚丙烯酰胺凝胶进行检测；同时我们将模板DNA、引物稀释到工作浓度后和DNTPs以及PCR Buffer一起放入到冰箱保鲜层中，使用时不需要融化，可直接吸取，3个月内均能正常使用。利用以上的方法最终确立了一套简单、快速、节约、污染小的甜菜品种真实性和纯度的鉴定体系,促进了该技术的大规模使用，利用优化后的程序，一个成熟的实验室操作人员只需一天就可以完成192份样品的检测。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-13
第一章综述  13-25
  1.1 品种纯度和真实性鉴定的意义及现状  13-21
    1.1.1 构建甜菜品种特征指纹图谱的意义  13
    1.1.2 种子真实性和纯度鉴定的方法  13-21
  1.2 应用 SSR 分子标记鉴定甜菜品种的真实性和纯度需要解决的问题  21-23
    1.2.1 快速提取甜菜基因组 DNA 的研究  21-22
    1.2.2 SSR-PCR 反应体系和程序的优化  22
    1.2.3 甜菜多重 SSR-PCR 反应体系的优化以及产物检测方法的改进  22
    1.2.4 甜菜 SSR 核心引物的筛选及指纹图谱的构建  22-23
  1.3 本研究的目的意义和技术路线  23-25
第二章不同方法快速提取甜菜干种子基因组 DNA 的研究  25-32
  摘要  25-26
  2.1 试验材料和方法  26-28
    2.1.1 试验材料  26
    2.1.2 试验试剂  26
    2.1.3 试验仪器  26-27
    2.1.4 试验方法  27-28
  2.2 结果和分析  28-31
    2.2.1 不同碱裂解法提取 DNA 浓度与纯度的检测  28-29
    2.2.2 SSR 结果分析  29-30
    2.2.3 不同方法提取甜菜干种子 DNA 浓度及纯度的检测  30
    2.2.4 不同方法提取甜菜干种子 DNA 的 SSR-PCR 检测结果  30-31
  2.3 讨论  31-32
第三章新型核酸染料在甜菜琼脂糖电泳中的应用  32-37
  摘要  32
  3.1 材料和试剂  32-33
    3.1.1 实验材料  32-33
    3.1.2 实验试剂  33
    3.1.3 主要仪器  33
  3.2 实验方法  33-34
    3.2.1 DNA 的提取  33
    3.2.2 1% 琼脂糖制备  33-34
    3.2.3 利用λ DNA 检测甜菜基因组 DNA 的浓度  34
    3.2.4 利用 GV 对 PCR 产物进行检测  34
  3.3 结果分析  34-35
    3.3.1 不同染料检测结果  34-35
    3.3.2 GV 对 PCR 产物检测的结果  35
  3.4 讨论  35-37
第四章甜菜 SSR 核心引物的筛选以及多重 PCR 体系的建立  37-57
  摘要  37-38
  4.1 实验材料和方法  38-43
    4.1.1 实验材料  38-39
    4.1.2 DNA 的提取  39
    4.1.3 实验中使用的 SSR 引物  39-42
    4.1.4 PCR 反应体系  42
    4.1.5 PCR 扩增产物的电泳及检测  42-43
  4.2 结果分析  43-55
    4.2.1 甜菜 SSR 核心引物的筛选  43-46
    4.2.2 能够构建多重 SSR-PCR 反应的引物  46-49
    4.2.3 甜菜 2-3 重 SSR-PCR 扩增体系的建立  49-51
    4.2.4 4 重和 5 重 SSR-PCR 反应体系  51-52
    4.2.5 4 重和 5 重 SSR-PCR 反应体系的优化  52-55
  4.3.讨论  55-57
第五章 46 份甜菜品种的 SSR 指纹图谱构建及遗传关系分析  57-69
  摘要  57
  5.1 材料与方法  57-60
    5.1.1 供试材料  57-59
    5.1.2 方法  59-60
  5.2 结果与分析  60-68
    5.2.1 DNA 提取结果及检测  60
    5.2.2 SSR 引物的扩增  60-61
    5.2.3 SSR 指纹图谱的构建  61-65
    5.2.4 聚类分析  65-68
  5.3 讨论  68-69
第六章快速鉴定甜菜品种纯度和真实性的研究  69-75
  摘要  69-70
  6.1 鉴定体系的优化  70-72
    6.1.1 DNA 提取方法的优化  70-71
    6.1.2 DNA 检测方法的优化  71
    6.1.3 PCR 反应体系和程序的优化  71
    6.1.4 电泳检测方法的优化  71-72
  6.2 结果与分析  72-74
    6.2.1 两种快速提取甜菜基因组 DNA 的比对  72
    6.2.2 PCR 反应体系和反应程序的优化  72-73
    6.2.3 优化后的方法与原方法对比结果  73
    6.2.4 PCR 反应体系和程序优化的比较  73-74
  6.3 讨论  74-75
第七章全文结论和创新点  75-77
  7.1 全文结论  75-76
  7.2 创新点  76-77
参考文献  77-88
附录  88-97
致谢  97-98
作者简历  98
在读期间发表的主要论文  98
在读期间发表的著作  98

甜菜栽培品种的DNA指纹图谱构建及遗传多样性分析

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