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大豆耐逆基因GmMYB84和GmPM30的初步功能研究及无选择标记转化载体构建

作　者: 秦梦茵
导　师: 向凤宁
学　校: 山东大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 大豆 GmMYB84 GmPM30 非生物胁迫耐受性无选择标记转化体系
分类号: S565.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

植物的耐逆性是由多基因控制的,这些基因构成了一个复杂的调控网络。因此对非生物胁迫下植物基因表达情况的研究有助于我们更全面的了解植物的耐逆机制。本实验室利用基因芯片技术,建立了大豆盐和非盐胁迫下的基因表达图谱,比较其基因表达差异,发掘参与耐盐胁迫的候选基因。本文从候选基因中克隆了一个MYB类转录因子基因和一个LEA蛋白基因,进行了初步功能研究。同时构建了一个双T-DNA载体建立了一个无选择标记转化体系,用于遗传转化研究。主要研究内容和结果包括：利用大豆基因芯片分析大豆盐诱导的基因表达图谱发现,有5573个探针发生了两倍以上的变化,占全部芯片的9.1%,其中2833个表现为上调,2740个表现为下调。其中MYB基因家族中有15个上调变化明显；LEA基因家族中有20个上调变化明显。从这两个基因家族中各挑选一个变化明显的基因进行克隆和功能研究。一、GmMYB84的克隆与初步功能分析1. GmMYB84基因的芯片结果验证半定量RT-PCR分析表明,GmMYB84基因在盐胁迫下,表达量随着胁迫时间的延长,表达量逐渐增加。2. GmMYB84蛋白结构、性质及系统进化分析GmMYB84基因编码的蛋白是典型的R2R3-MYB蛋白,具有两个MYB结构域从属于R2R3-MYB类蛋白的第20亚群。该蛋白是亲水性蛋白。3. GmMYB84转录激活活性分析利用酵母转录激活体系证明该蛋白具有转录激活活性。4. GmMYB84基因表达模式分析半定量RT-PCR结果表明GmMYB84在大豆的根和花中表达量最高,在茎、叶和种子中表达量较低,且其受盐胁迫和ABA的明显诱导,不受干旱和冷胁迫的诱导。5.GmMYB84的克隆及拟南芥过表达株系的获得克隆GmMYB84基因cds全长,构建植物表达载体,并转化拟南芥,得到该基因的过表达T2代纯系。6.GmMYB84拟南芥过表达系的耐盐性分析通过对不同盐浓度下种子萌发率比较发现,随着盐浓度的升高,过表达系的萌发率高于野生型的趋势越来越明显。通过对不同盐浓度下根长的比较发现,在含有150mM和200mM NaCl的1/2MS培养基上,过表达系植株的根长比野生型长。盐浓度梯度处理结果显示,过表达系植株的株高高于野生型。高盐胁迫处理结果显示,过表达系植株的存活率高于野生型。综上标明,GmMYB84在拟南芥中的异位表达提高了植株耐盐性。二.GmPM30的获得与初步功能分析1.GmPM30基因的芯片结果验证RT-PCR分析表明,GmPM30基因在盐胁迫下,表达量随着胁迫时间的延长而逐渐增加。2.GmPM30蛋白结构、性质及系统进化分析GmPM30基因编码的蛋白是亲水性蛋白,属于第四类LEA蛋白。3.GmPM30表达模式分析半定量RT-PCR结果表明,GmPM30在大豆的根、花和种子中表达量最高,在茎和叶中几乎不表达；且GmPM30受盐、干旱、冷胁迫和ABA的明显诱导。4.GmPM30的克隆及拟南芥转化克隆了GmPM30基因cds全长,构建了植物表达载体,并转化拟南芥,得到该基因的过表达纯系。S.GmPM30拟南芥过表达株系系耐盐/旱/冷性分析不同盐浓度下种子萌发率比较发现,随着盐浓度的升高,过表达系的萌发率高于野生型的趋势越来越明显。不同盐浓度下根长的比较发现,在含有150mM和200mM NaCl的1/2MS培养基上,过表达系植株的根长比野生型长。高盐胁迫处理结果显示,过表达系植株的存活率高于野生型。干旱胁迫处理显示,GmPM30过表达系植株的存活率高于野生型。叶片失水率结果显示,GmPM30过表达系植株叶片的失水率低于野生型。GmPM30过表达系耐冷性分析结果显示,GmPM30过表达系植株没有表现出明显的耐冷性。三、无选择标记转化体系初步建立构建了一个农杆菌双元表达载体构建,该双元表达载体含有两个T-DNA边界,每个T-DNA边界内分别含有目的基因和抗性标记基因,用于大豆的遗传转化,所得后代中能够分离出不含抗性标记基因的转基因植株。

全文目录

中文摘要  7-10
Abstract  10-13
縮略词  13-14
第一章文献综述  14-34
  1 植物耐逆性研究  14-15
    1.1 植物的耐盐性  14
    1.2 植物的耐旱性  14-15
    1.3 植物的耐冷性  15
  2 MYB转录因子  15-22
    2.1 植物中的MYB转录因子  15-16
    2.2 植物MYB转录因子的结构和分类  16-19
    2.3 植物MYB转录因子的起源与进化  19-20
    2.4 植物MYB转录因子的功能  20-22
  3 植物LEA蛋白  22-29
    3.1 LEA蛋白的性质  23
    3.2 LEA蛋白的结构特征和分类  23-25
    3.3 LEA蛋白的业细胞定位  25-26
    3.4 LEA蛋白的功能  26-28
    3.5 LEA蛋白基因表达的调控  28-29
  4 植物遗传转化  29-34
    4.1 转基因与食品安全  29-31
    4.2 植物转化中的安全标记基因  31-32
    4.3 抗性标记基因剔除技术  32-34
第二章 MYB转录因子的克隆及功能分析  34-72
  2.1 实验材料和方法  34-48
    2.1.1 实验材料  34-36
    2.1.2 各种溶液及培养基的配制  36-38
    2.1.3 实验方法  38-48
  2.2 实验结果与分析  48-70
    2.2.1 候选MYB基因的筛选及芯片结果验证  48-49
    2.2.2 MYB蛋白结构、性质及其系统进化分析  49-53
    2.2.3 GmMYB84/173/184的组织特异性表达  53-54
    2.2.4 非生物胁迫和植株激素对大豆GmMYB84表达的影响  54-55
    2.2.5 GmMYB84基因的克隆及表达载体的构建  55-58
    2.2.6 GmMYB84的转录激活活性分析  58-60
    2.2.7 过表达拟南芥株系的筛选及鉴定  60-61
    2.2.8 GmMYB84拟南芥过表达株系的表型  61-62
    2.2.9 GmMYB84过表达拟南芥的耐盐性分析  62-67
    2.2.10 GmMYB84过表达拟南芥对ABA的响应  67-70
  2.3 讨论  70-72
第三章 GMPM30的克隆及功能分析  72-99
  3.1 实验材料和方法  72-76
    3.1.1 实验材料  72-73
    3.1.2 各种溶液及培养基的配制  73
    3.1.3 实验方法  73-76
  3.2 结果与分析  76-97
    3.2.1 候选GmPM30基因的获得及芯片结果验证  76-77
    3.2.2 GmPM30蛋白结构及系统进化分析  77-78
    3.2.3 GmPM30的组织特异性表达  78-79
    3.2.4 非生物胁迫和植株激素对GmPM30表达的影响  79-80
    3.2.5 GmPM30基因的克隆及表达载体的构建  80-83
    3.2.6 过表达拟南芥株系的筛选及鉴定  83-84
    3.2.7 GmPM30过表达系的表型  84-85
    3.2.8 GmPM30过表达能够提高拟南芥的盐耐受性  85-89
    3.2.9 GmPM30过表达能够提高拟南芥的干旱耐受性  89-91
    3.2.10 GmPM30过表达拟南芥的抗冷分析  91-92
    3.2.11 GmPM30过表达拟南芥对ABA的响应  92-95
    3.2.12 GmPM30的大豆遗传转化  95-97
  3.3 讨论  97-99
第四章无选择标记转化体系的初步建立  99-110
  4.1 实验材料和方法  99-102
    4.1.1 实验材料  99
    4.1.2 实验方法  99-102
  4.2 实验结果与分析  102-108
    4.2.1 实验设计  102-104
    4.2.2 载体pROK2’的获得及验证  104-105
    4.2.3 载体pROK2"的获得及验证  105-107
    4.2.4 植物双元表达载体的获得及验证  107-108
  4.3 讨论  108-110
论文创新点  110-111
参考文献  111-121
致谢  121-122
附录  122-124
学位论文评阅及答辩情况表  124

大豆耐逆基因GmMYB84和GmPM30的初步功能研究及无选择标记转化载体构建

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