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OsDREB3转基因大豆品系特异性检测方法的研究

作　者: 刘营
导　师: 高学军
学　校: 东北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 转基因大豆OsDREB3 染色体步移品系特异性多重巢式拷贝数标准分子
分类号: S565.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

转基因食品的安全性及对生态环境的影响等问题一直是关注的焦点。目前商业化的转基因大豆主要为抗草甘膦大豆,抗逆基因的转基因大豆因地理环境及全球商业化的需求的增多,商业化的呼声也越来越高,但迄今为止我国尚未建立抗逆转基因大豆的检测技术。本实验以已进入环境释放或生产性试验、或获得安全证书的转基因植物环境安全评价阶段的耐低温抗逆转基因大豆新品系转基因大豆OsDREB3为研究对象,利用染色体步移技术,获得了转基因大豆OsDREB35’端和3’端旁侧序列信息。通过生物信息学分析方法明确了5’端旁侧序列344bp覆盖了转化载体及转基因大豆基因组,在大豆基因组为1号染色体,位置为49,828,108～49,836,357；3’端旁侧序列共长2189bp,属未知基因序列。本实验根据已得到的5’端旁侧序列信息,建立了转基因大豆OsDREB3品系特异性定性和定量检测方法。品系特异性检测定性和定量引物所扩增片段覆盖了大豆基因组及转化载体序列信息,在检测过程中随机选择了4种转基因大豆,2种转基因玉米,2种转基因水稻同时进行品系特异性定性及定量检测,结果显示除转基因大豆OsDREB3有扩增片段或扩增曲线外,其余转基因作物均没有扩增片段或扩增曲线,表明该定性及定量检测方法符合品系特异性检测要求。定性检测扩增片段大小为160bp。检测灵敏度为0.1%,比欧盟检测下限(0.9%)低,且重现性好,可用于转基因大豆OsDREB3定性检测。所设计的荧光定量PCR引物,扩增曲线检测下限可达0.01%。建立了转基因大豆多重PCR检测方法和转基因大豆OsDREB3巢式PCR检测方法。本实验选择了转基因大豆GTS40-3-2、转基因大豆A2704-12及转基因大豆OsDREB3DNA作为待检测基因模板,对多重PCR体系中的成分进行了多次调整,尝试了多种不同引物对的配比,扩增片段大小相差100多个碱基,范围从700bp～200bp之间,可视性好。最终确定了最佳检测方案,成功实现了3种转基因大豆、4组不同片段的同时扩增和检测,检测下限可达0.01%。巢式PCR所用引物在满足品系特异定性检测的同时,也要提高其检测的灵敏度,本实验所建立巢式PCR检测方法,检测灵敏度可达0.005%。本实验在原有构建有4种转基因大豆品系特异性序列的标准分子的基因上又构建了转基因大豆OsDREB3品系特异性序列,新构建的含有5种转基因大豆品系特异性序列及大豆内参基因lectin的阳性对照标准分子,本实验通过实时荧光定量PCR方法,以大豆凝集素基因(lectin)作为内源参照基因,确定了外源基因OsDREB3在转基因大豆OsDREB3基因组为单拷贝作物。本实验希望通过染色体步移技术得到的OsDREB3外源基因旁翼序列,建立起来的转基因大豆OsDREB3一整套灵敏高、重现性好、可信度高、特异性强的品系特异性检测体系,充分提高了转基因大豆检测工作效率,从而完善了现有转基因大豆标准分子在OsDREB3抗旱基因检测方面的不足,为我国建立转基因大豆OsDREB3标识管理制度提供参考。该方法为建立转基因大豆OsDREB3标准体系提供技术支持,并为转基因产品标识制度的规范提供有价值的参考。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
1 前言  12-26
  1.1 转基因大豆及生物安全国内外进展  12-15
    1.1.1 转基因大豆的国内外发展现状  12-13
    1.1.2 DREB抗旱基因研究进展  13-14
    1.1.3 转基因大豆与生物安全  14-15
  1.2 染色体步移技术的应用及发展  15-19
    1.2.1 染色体步移技术的概述  15-16
    1.2.2 染色体步移技术在转基因作物研究的应用  16-18
    1.2.3 染色体步移技术技术的展望  18-19
  1.3 转基因大豆外源基因检测技术  19-24
    1.3.1 转基因大豆及其制品检测现状  19
    1.3.2 转基因生物外源基因检测技术的分类  19-22
    1.3.3 转基因大豆外源基因检测技术  22-24
  1.4 转基因大豆饲料安全与安全性评价  24-25
  1.5 本研究的目的和意义  25-26
2 材料与方法  26-44
  2.1 实验材料  26-27
    2.1.1 检测样品  26
    2.1.2 主要试剂  26
    2.1.3 主要仪器  26-27
  2.2 转基因大豆OsDREB3外源基因旁侧序列分析和验证  27-31
    2.2.1 转基因大豆OsDREB3外源基因旁侧序列分析  27-30
    2.2.2 转基因大豆OsDREB3外源基因旁侧序列验证  30-31
  2.3 转基因大豆OsDREB3特异性检测  31-37
    2.3.1 转基因大豆OsDREB3品系特异性定性PCR检测方法的建立  31-33
    2.3.2 转基因大豆OsDREB3品系特异性定量PCR检测方法的确定  33-34
    2.3.3 转基因大豆多重PCR定性检测  34-35
    2.3.4 转基因大豆OsDREB3巢式PCR定性检测  35-37
  2.4 转基因大豆OsDREB3外源基因拷贝数的确定及标准分子的构建  37-44
    2.4.1 转基因大豆OsDREB3外源基因拷贝数的确定  37-39
    2.4.2 转基因大豆标准分子构建  39-44
3 结果与分析  44-62
  3.1 转基因大豆OsDREB3外源基因旁侧序列分析  44-50
    3.1.1 转基因大豆OsDREB3外源基因旁侧序列分离  44-47
    3.1.2 转基因大豆OsDREB3外源基因旁侧序列验证  47-50
  3.2 转基因大豆OsDREB3品系特异性检测  50-58
    3.2.1 转基因大豆OsDREB3品系特异性定性PCR检测方法的建立  50-53
    3.2.2 转基因大豆OsDREB3品系特异性定量PCR检测方法的建立  53-56
    3.2.3 多重PCR定性检测方法的建立  56-57
    3.2.4 转基因大豆OsDREB3巢式PCR定性检测  57-58
  3.3 转基因大豆OsDREB3拷贝数确定及标准分子构建  58-62
    3.3.1 转基因大豆OsDREB3拷贝数的确定  58-60
    3.3.2 转基因大豆OsDREB3标准分子的构建  60-62
4 讨论  62-69
  4.1 转基因大豆OsDREB3外源基因旁侧序列生物信息学分析  62-63
    4.1.1 染色体步行获得品系特异性特异序列  62-63
    4.1.2 转基因大豆OsDREB3外源基因旁侧序列生物信息学分析  63
  4.2 转基因大豆OsDREB3特异性检测方法的建立  63-66
    4.2.1 转基因大豆OsDREB3品系特异性定性PCR检测方法的建立  63-64
    4.2.2 转基因大豆OsDREB3品系特异性定量PCR检测方法的建立  64-65
    4.2.3 转基因大豆多重PCR定性检测方法的建立  65
    4.2.4 转基因大豆OsDREB3巢式PCR定性检测方法的建立  65-66
  4.3 转基因大豆OsDREB3拷贝数的确定及标准分子构建  66-67
    4.3.1 转基因大豆OsDREB3拷贝数的确定  66-67
    4.3.2 转基因大豆OsDREB3标准分子的构建  67
  4.4 转基因大豆作为动物饲料的展望  67-69
5 结论  69-70
致谢  70-71
参考文献  71-79
附录  79-84
攻读学位期间发表的学术论文  84

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