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水稻抗病相关基因OsDRxoc1和OsDRxoc2的克隆和功能分析

作　者: 陈明
导　师: 丁新华; 储昭辉
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 细菌性病害水稻细菌性条斑病白叶枯病超量表达 RNA抑制技术 MYB转录因子
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

水稻细菌性条斑病(简称细条病)是我国最重要的水稻细菌性病害之一,在我国南方的某些地区发病情况比较严重,平均每年造成水稻减产10%-20%,最高减产可达40%(王金友,1995；童贤明等,1995),成为这些地区的重点防治病害。目前还没有有效的防治水稻细菌性条斑病的方法,鉴于化学防治污染环境,不利于现代农业的可持续发展,选育和培育抗病品种是最为经济有效的方法。水稻对细条病的抗性属于典型的数量性状,因此,深入挖掘现有资源中的数量抗性基因座(Quantitative resistance locus,ORL),不仅具有重要的实践应用价值,而且可以对数量抗病性的机制研究提供帮助。本研究分离克隆了两个病原诱导表达基因OsDRxoc1(编码MYB蛋白)和OsDRxoc2(编码未知蛋白),并利用超量表达和双链RNAi抑制技术对以上两个基因进行功能验证,探索基因OsDRxoc1和OsDRxoc2在细条病菌与水稻互作中的功能。对OsDRxoc1基因分别构建了超量表达载体pU1301-OSDRxoc1和抑制表达载体ds1301-OSDRxoc1；对OsDRxoc2基因分别构建了超量表达载体pU1301-OSDRxoc2和抑制表达载体ds1301-OSDRxoc2,导入农杆菌工程菌株EHA105。采用农杆菌介导的遗传转化法将上述OsDRxoc1基因两个载体转化中花11,分别获得PCR检测阳性转基因植株17和26株。OsDRxoc2基因两个载体分别转化牡丹江8号和中花11,分别获得PCR检测阳性牡丹江8号转基因植株11和21株,中花11转基因植株13和26株。观察TO代转基因株系表型发现,OsDRxoc1基因超量表达植株在生长过程中相对于野生型植株出现植株矮小,叶片黄化,花期延迟,结实率降低的表型,通过进一步研究发现出现叶片黄化的表型是由于OsDRxoc1基因的超量表达导致植株叶片中叶绿素含量降低所致。采用活体穿刺法和剪叶法分别接种细菌性条斑病菌株RS105和水稻白叶枯病菌株PXO99。对OsDRxoc1转基因植株进行分析,超量表达植株显著提高了对细菌性条斑病菌株RS105的抗性,抑制表达转基因植株也相比野生型呈现出更易感病的表型；与此相反,超量表达植株对白叶枯病菌株PXO99表现更感病,而抑制表达转基因植株对PXO99表现更抗病。研究结果显示OsDRxoc1基因参与水稻抗病和植株发育,同时通过其对同属于水稻黄单胞菌的两种不同致病变种截然相反的抗病表型,推测其参与的病害互作途径可能涉及白叶枯和细菌性条斑病侵染机制的核心差异,可帮助解析一些重要的学术问对OsDRxoc2转基因植株分析表明,超量或抑制表达不影响水稻对细条病菌RS105的抗性,但超量表达植株明显提高了对白叶枯病菌株PXO99的抗性,抑制表达转基因植株也相比野生型呈现出更易感病的表型；同时干旱胁迫处理结果表明超量表达OsDRxoc2基因的转基因株系,提高了对干旱胁迫的抗逆性,以上结果表明OsDRxoc2基因可能参与水稻白叶枯病的抗性反应并在水稻的抵抗逆境胁迫中有重要作用。

全文目录

中文摘要  9-11
ABSTRACT  11-13
1 前言  13-26
  1.1 水稻细条病的研究概况  13-17
    1.1.1 水稻细条病的发现及发病特点  13-14
    1.1.2 病原菌的分类与文化  14-15
    1.1.3 细条病抗性评价方法  15
    1.1.4 水稻细条病的抗性鉴定与抗源筛选  15-16
    1.1.5 水稻细条病的抗性生理研究  16-17
  1.2 水稻细条病抗性遗传及抗性QTL和基因  17-19
    1.2.1 水稻细条病抗性遗传  17
    1.2.2 水稻细条病抗性QTL研究进展  17-18
    1.2.3 水稻细条病抗性基因研究进展  18-19
  1.3 植物抗病相关基因的研究方法  19-22
    1.3.1 克隆植物抗病相关基因  19-20
      1.3.1.1 鸟枪克隆法(Shotgun Cloning)  19
      1.3.1.2 转座子标签法(Transposon Tagging)  19
      1.3.1.3 图位克隆法(Map-based cloning)  19-20
    1.3.2 寻找有表达差异的基因  20-22
      1.3.2.1 mRNA差异显示技术(mRNA differential display)  20
      1.3.2.2 mRNA表达谱分析  20
      1.3.2.3 扣除性cDNA杂交法(subtractive cDNA hybridization)  20-21
      1.3.2.4 抑制性扣除杂交法(suppression subtractive hybridization,SSH)  21
      1.3.2.5 DNA微阵列(DNA microarray)  21-22
    1.3.3 生物信息学的方法用于抗病基因的发现和鉴定  22
  1.4 植物MYB转录因子基因的研究现状  22-24
    1.4.1 在植物方面已经研究出来的MYB基因及相关功能  22-24
      1.4.1.1 参与苯丙素代谢途径  22-23
      1.4.1.2 参与细胞分化、形态建成的发育调控  23
      1.4.1.3 参与植物对激素的应答  23
      1.4.1.4 参与植物对生物和非生物胁迫的应答  23-24
      1.4.1.5 参与细胞周期的调控  24
      1.4.1.6 作为一种端粒结合蛋白对染色体起保护作用  24
  1.5 本研究的目的与意义  24-26
2 材料与方法  26-34
  2.1 水稻品种和来源  26
  2.2 菌株和载体  26
  2.3 引物设计  26-27
  2.4 OsDRxoc1和OsDRxoc2基因序列PCR扩增  27-29
    2.4.1 PCR产物纯化  28-29
  2.5 水稻超量表达载体和抑制表达载体的构建  29
  2.6 农杆菌介导的水稻遗传转化  29-30
  2.7 超量表达转基因植株GUS染色  30
  2.8 转基因植株PCR检测  30-31
  2.9 细条病接种和病情鉴定  31
  2.10 白叶枯病接种和病情鉴定  31
  2.11 OsDRxoc2转基因植株干旱胁迫处理  31
  2.12 OsDRxoc2转基因植株盐胁迫处理  31
  2.13 转基因植株基因表达荧光定量PCR分析  31-34
    2.13.1 植物总RNA的提取  32
    2.13.2 RT-PCR  32-33
    2.13.3 转基因植株基因表达荧光定量PCR分析  33
    2.13.4 分光光度法测定OsDRxoc1转基因植株叶片的叶绿素含量  33-34
3 结果与分析  34-53
  3.1 基因OsDRxoc1和OsDRxoc2结构与功能预测  34-36
  3.2 基因OsDRxoc1和OsDRxoc2超量表达和抑制表达片段的扩增  36-37
  3.3 水稻超量表达载体和抑制表达载体的构建  37-40
    3.3.1 pU1301-OsDRxoc2植物超量表达载体的构建  37
    3.3.2 ds1301-OsDRxoc2植物抑制表达载体的构建  37-39
    3.3.3 pU1301-OsDRxoc1植物超量表达载体的构建  39-40
    3.3.4 ds1301-OsDRxoc1植物抑制表达载体的构建  40
  3.4 水稻遗传转化再生体系的建立  40-41
  3.5 T0代超量表达转基因植株GUS染色分析  41
  3.6 T0代转基因植株PCR检测  41-42
  3.7 T0代超量表达和抑制表达转基因植株表型分折  42-43
  3.8 转基因植株病原接种鉴定和分析  43-48
    3.8.1 OsDRxoc2 T1代水稻转基因植株病原接种鉴定和分析  43-45
    3.8.2 OsDRxoc1转基因植株病原接种鉴定和分析  45-48
  3.9 OsDRxoc2转基因植株干旱和盐胁迫处理  48-50
    3.9.1 OsDRxoc2转基因植株的盐胁迫处理  48-49
    3.9.2 OsDRxoc2转基因植株干旱胁迫处理  49-50
  3.10. OsDRxoc1转基因植株叶片的叶绿素含量测定  50-51
  3.11 荧光定量RT-PCR分析  51-53
4 讨论  53-55
  4.1 关于OsDRxoc1和OsDRxoc2基因  53
  4.2 MYB蛋白可能参与了水稻与细条病菌的互作反应  53-54
  4.3 抗病相关基因的鉴定对植物抗病研究的贡献  54-55
5 结论  55-57
  5.1 OsDRxoc1的超量表达提高了水稻植株对细条病菌RS105的抗性  55
  5.2 OsDRxoc1的超量表达影响了水稻植株正常生长发育  55-56
  5.3 超量表达OsDRxoc2提高了水稻植株对白叶枯病菌PXO99的抗性  56
  5.4 OsDRxoc2的超量表达提高了水稻植株对干旱胁迫的抗性  56-57
参考文献  57-69
附录  69-76
致谢  76-77
攻读学位期间发表论文情况  77

水稻抗病相关基因OsDRxoc1和OsDRxoc2的克隆和功能分析

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