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硅提高水稻抗锰毒害的生理和分子机制

作　者: 李萍
导　师: 梁永超
学　校: 中国农业科学院
专　业: 植物营养
关键词: 水稻锰胁迫硅抗性基因表达
分类号: S511
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本研究旨在揭示硅调控水稻锰营养的生理效应及分子机制，为减轻水稻的锰毒害、提高水稻产量并促进水稻生产的持续发展提供理论依据。通过水培试验，采用两个对Mn耐性不同的水稻品种，XXY640（锰敏感型）和ZLY99（耐锰型）作为试验材料，研究了硅（1.5mmol·L-1）对高锰（2mmol·L-1）胁迫下水稻的生长、元素吸收、运输及分布、抗氧化体统和光合作用的影响；利用敏感型品种为材料，采用Solexa高通量测序技术获得了高锰胁迫下加硅和不加硅处理的水稻基因表达图谱；根据测序结果，通过Gene Ontology和Pathway显著性富集分析，得到有关光合作用过程中差异表达显著基因；并利用实时荧光定量PCR技术研究这些关键基因相对表达量的影响。主要结果如下：（1）两个水稻品种对高锰胁迫反应存在巨大差异，高锰胁迫严重抑制了敏感品种的干物质重，使其叶片毒害症状明显。加硅处理增强了两个品种对锰毒的抗性，硅抑制了锰从敏感品种地下部到地上部的转移，而对耐性品种来说，硅则抑制了锰的吸收，从而降低了锰的毒害。（2）高锰胁迫下，耐性品种叶片和根系的Mn含量都显著高于敏感品种。高锰胁迫抑制了敏感品种K元素从根部向叶片的转移，而降低了耐性品种的根部吸收K元素的能力。高锰胁迫下，施硅处理，增加了敏感品种叶片中K、Fe和Zn的相对含量；显著增加耐性品种叶片中K和Zn的相对含量，显著降低其Ca和Fe的相对含量。高锰胁迫下施硅可以促进敏感品种K元素的转运。Si对耐性品种根系中各元素含量保持相对平衡具有重要作用。（3）在Mn胁迫下，敏感品种根系的超氧化物歧化酶（SOD）活性、抗坏血酸（AsA）和非蛋白巯基（NPT）含量显著增加，但过氧化物酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）酶活性显著降低，谷胱甘肽（GSH）含量也显著降低，最终导致膜脂过氧化加剧，丙二醛（MDA）含量升高，质膜完整性遭到破坏，根系受到伤害。Mn胁迫下，耐性品种根系的GSH和AsA含量增加，但CAT酶活性和NPT含量降低，导致MDA含量升高，根系受到伤害。加Si后增强了水稻根系抗氧化系统物质活性，降低MDA和过氧化氢（H2O2）含量，缓解水稻根系受到的伤害。且这种缓解效应在敏感品种根系的更为显著。高锰胁迫显著增加了敏感品叶片的SOD、CAT和APX活性，但是显著降低了NPT和GSH含量，因此导致了H2O2和MDA大量累积，植株受到伤害。加硅后显著降低了其MDA和H2O2含量，促进了植物生长。对于耐性品种来说，高锰胁迫下，叶片中SOD活性和和GSH含量显著增加，增强了其清除自由基的能力，导致低的氧化胁迫。高锰胁迫下，加硅处理显著影响了敏感品种非酶抗氧化物质的活性。（4）锰胁迫下，敏感品种的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和叶绿素总量显著降低，而耐性品种仅类胡萝卜素含量显著下降。两个品种的光合速率在锰胁迫下都显著降低。扫描电镜和透射电镜结果表明，锰胁迫使敏感品种叶片气孔关闭，基粒片层紊乱，而耐性品种气孔开度略有减小，叶绿体片层结构基本不受影响。加硅之后，锰胁迫下敏感品种的叶绿素总量和类胡萝卜素含量显著增加，耐性品种的类胡萝卜素含量也增加，敏感品种的光合速率也显著增加，气孔开度增大。（5）高锰胁迫下有效差异表达(fdr≤0.001和|log2Ratio|≥1)的基因为2831个，其中上调1336个，下调1495个。高锰胁迫下施硅后差异表达基因上调表达647个，下调表达892个。正常锰浓度下，施硅后基因表达16525个，其中上调表达1558个，下调2028个。同时进行硅处理和锰处理时与单硅处理相比，表达基因16273个，上调表达320个，下调表达172个。锰胁迫下施硅后差异表达基因功能分析表明：差异表达基因涉及到转录因子，转运子，转移酶蛋白等基因，涉及到植物体内的初生代谢和次生代谢等过程。研究结果表明水稻应答锰胁迫的机理非常复杂，涉及到代谢调节、离子转运、信号传导、转录调节和逆境应答等大量基因协调表达结果。（6）根据高通量测序结果，通过实时荧光定量PCR分析了敏感品种中光合作用显著差异表达基因表达量变化情况。结果表明，高锰胁迫下，叶绿素合成受阻，天线色素捕光过程受影响，PSI结构受损，卡尔文循环过程CO2固定的受体大大减少，这些因素综合导致植物体的光合作用下降。锰胁迫下加硅后，可以增加叶绿素含量、光能利用率和ATP数量，稳定PSI结构，促进CO2的同化，因此减轻了作物锰毒害的程度。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-18
第一章绪论  18-24
  1.1 引言  18
  1.2 国内外研究进展  18-22
    1.2.1 土壤中的锰及形态  18-19
    1.2.2 锰在植物中的生理作用  19-20
    1.2.3 植物对锰毒的耐性机制  20-21
    1.2.4 锰毒的矫正  21-22
  1.3 本研究的目的、意义和技术路线  22-24
第二章材料与方法  24-34
  2.1 植物培养  24
  2.2 元素含量测定  24-25
    2.2.1 植物采集  24
    2.2.2 Mn 含量测定  24
    2.2.3 Si 含量测定  24-25
    2.2.4 同步辐射 x-射线荧光（SRXRF）扫描  25
    2.2.5 X 射线吸收光谱（XAS）的测定  25
  2.3 抗氧化系统指标测定  25-26
    2.3.1 蛋白质含量的测定  25
    2.3.2 丙二醛（MDA）含量和过氧化氢（H2O2）含量的测定  25
    2.3.3 组织化学分析  25-26
    2.3.4 抗氧化系统酶活性的测定  26
  2.4 光合作用和叶绿素测定  26
  2.5 超微结构试验  26-27
  2.6 高通量测序  27-30
    2.6.1 实验流程  27
    2.6.2 信息分析流程  27-28
    2.6.3 以实时荧光定量 PCR 验证高通量测序数据  28-30
  2.7 实时荧光定量 PCR 测定光合作用相关基因  30-33
    2.7.1 总 RNA 提取  30
    2.7.2 RNA 完整性和纯度检测  30
    2.7.3 RNA 样品的反转录  30-31
    2.7.4 基因的定量分析  31-33
    2.7.5 Real-Time PCR 数据分析方法  33
  2.8 数据分析  33-34
第三章硅对过量锰胁迫下水稻植株生长的影响  34-38
  3.1 引言  34
  3.2 结果与分析  34-37
    3.2.1 硅对高锰胁迫下水稻植株生长的影响  34-35
    3.2.2 硅对高锰胁迫下水稻干物质累积的影响  35
    3.2.3 不同处理下水稻体内 Si 的含量变化  35-36
    3.2.4 不同处理下水稻体内 Mn 的含量变化  36-37
  3.3 讨论  37-38
第四章硅对锰胁迫下水稻吸收矿质元素的影响  38-44
  4.1 引言  38
  4.2 结果与分析  38-42
    4.2.1 锰及与其他元素在水稻叶片组织水平的分布的特征  38-40
    4.2.2 锰及与其他元素在水稻根系组织水平的分布的特征  40-41
    4.2.3 锰在水稻叶片的化学形态  41-42
  4.3 讨论  42-44
第五章硅对过量锰胁迫下水稻膜脂质过氧化作用和抗氧化系统的调控机理  44-51
  5.1 引言  44
  5.2 结果与分析  44-49
    5.2.1 Si 对 Mn 胁迫下水稻根系质膜完整性和质脂过氧化的影响  44-45
    5.2.2 Si 对 Mn 胁迫下水稻 MDA 和 H2O2含量的影响  45-46
    5.2.3 Si 对 Mn 胁迫下水稻 SOD、APX 和 CAT 活性的影响  46-48
    5.2.4 Si 对 Mn 胁迫下水稻 AsA、GSH 和 NPT 含量的影响  48-49
  5.3 讨论  49-51
第六章硅对高锰胁迫下两个水稻品种的光合生理和超微结构的影响  51-58
  6.1 引言  51
  6.2 结果与分析  51-56
    6.2.1 Si 对 Mn 胁迫下两个水稻品种叶绿素和类胡萝卜素含量的影响  51-53
    6.2.2 Si 对 Mn 胁迫下两个水稻品种光合速率参数的影响  53
    6.2.3 Si 对 Mn 胁迫下两个水稻叶片表皮气孔的影响  53-55
    6.2.4 Si 对 Mn 胁迫下两个水稻品种叶绿体超微结构的影响  55-56
  6.3 讨论  56-58
第七章应用高通量测序技术分析锰胁迫下水稻叶片基因的差异表达谱  58-70
  7.1 引言  58
  7.2 结果与分析  58-67
    7.2.1 高通量测序结果分布  58-59
    7.2.2 各种处理下的水稻基因差异表达谱  59-62
    7.2.3 差异表达基因代谢途径显著性富集分析  62-66
    7.2.4 差异表达基因的实时荧光定量 PCR 分析  66-67
  7.3 讨论  67-70
第八章硅对水稻敏感品种锰胁迫下光合作用相关基因表达的影响  70-79
  8.1 引言  70
  8.2 结果与分析  70-77
    8.2.1 提取的总 RNA 完整性和纯度鉴定  70-71
    8.2.2 cDNA 模板质量和待测基因引物的特异性检验  71-72
    8.2.3 实时荧光定量 PCR 的可靠性  72-75
    8.2.4 基因表达相对定量分析  75-77
  8.3 讨论  77-79
第九章全文结论  79-80
参考文献  80-96
致谢  96-97
作者简历  97

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