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菌根真菌和生物有机肥结合对棉花土传黄萎病防控作用及其机制

作　者: 张国漪
导　师: 冉炜
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物营养
关键词: 棉花黄萎病死谷芽孢杆菌地表球囊霉根际土壤根系分泌物
分类号: S435.621.24
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

棉花土传黄萎病是棉花连作障碍的主要病害之一,是一种典型的土传病害,其病原菌为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb).传统的化学防控通常会带来环境问题而田间防控措施如轮作和采用抗病品种等也存在许多限制性因素,生物防控日渐成为克服土传植物病害的重要途径。已有的研究表明菌根真菌或死谷芽孢杆菌菌株(Bacillus vallismortis,HJ-5)单独施用对防控棉花土传黄萎病有效果,但二者共同接种对防控棉花土传黄萎病的防控效果和协同作用机制尚未见报道。本文首先通过盆栽试验筛选了适于双接种试验的菌根菌菌株和菌株HJ-5的菌剂接种量。通过三次独立的温室盆栽试验研究了结合施用地表球囊霉(Glomus versiforme, Gv)和死谷芽孢杆菌强化的生物有机肥对棉花土传黄萎病的防病效果。采用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)标记技术构建了菌株HJ-5的GFP标记菌株(GHJ-5),研究了菌株GHJ-5在植株根表和根际的定殖行为。在温室条件下利用分根试验研究了菌株HJ-5和Gv单独接种和混合接种对棉花根系分泌物及抑病效果的影响。另外,还通过一系列的实验室和温室试验了研究病原菌和拮抗菌之间的互作关系。主要结果如下。1.筛选菌根菌和菌株HJ-5接种量的试验结果表明,双接种处理的最适菌根菌菌剂为菌株Gv,菌株HJ-5的最适用量为107CFU·g-1.菌株Gv和HJ-5双接种处理的土传黄萎病发病率最低,发病指数下降了26.71%,植株生物量显著增加。2.三次独立的盆栽试验一致表明,育苗时先接种菌根真菌菌株Gv,移栽时再在连作土壤中施用死谷芽孢杆菌发酵的生物有机肥,防控棉花土传黄萎病的效果最好,发病指数平均降低65%,植株地上部高度,叶面积,地上,下部干重量三次平均分别增加75%,44%,216%,和71%。植株地上部和地下部N和P含量显著增加。对照相比,植株地上部和地下部N含量分别增加83%和65%；地上部和地下部P含量分别增加49%和45%。根际土壤Verticillium dahliae数量显著降低,下降幅度达83%。值得注意的是,菌株Gv在植物根的定殖没有受施用HJ-5生物有机肥的影响。3.实验室分析表明,菌株HJ-5能产生脂肽类物质、吲哚乙酸(IAA)、铁载体、氰化氢(HCN)、氨气,但不产脱氨酶(ACC),不具有解磷能力。GFP标记菌株GHJ-5能够定殖在土传黄萎病病原菌的菌丝上并使其变形和裂解,表明菌株HJ-5为土传黄萎病的拮抗菌。4.双接种菌株Gv和GHJ-5的盆栽试验结果表明,与单接种菌株GHJ-5或Gv相比,棉花植株的生物量、根系密度、植株磷含量、棉花植株根内和根际的菌株GHJ-5的数量都有显著增加,说明菌株Gv与GHJ-5双接种能够促进棉花的生长。5.分根试验表明,双接种菌株Gv和HJ-5处理棉花土传黄萎病发病指数比对照下降了63.3%。棉花根系分泌物中发现4种酚酸,所有酚酸在低浓度时促进大丽轮枝菌的生长和孢子的萌发,浓度升高到一定程度,抑制病原菌孢子的生长。接种菌株Gv和HJ-5显著地减低了根系分泌物中酚酸类物质的浓度。接种V. dahliae、菌株Gv或HJ-5均系统性地改变了根系分泌物的组成。6.对盆栽试验植株样品的分析表明,双接种菌株Gv和HJ-5显著提高了植株防卫酶如内过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、几丁质酶等酶的活性,增加了叶片水杨酸和叶绿素含量、降低了植株茎基部胼胝质含量,减轻棉花土传黄萎病发病症状。综上所述,本文证实了菌株Gv和HJ-5双接种处理具有协同促进植物生长和抑制植物病原菌生长的作用。菌株Gv能够帮助植物吸收土壤中的养分元素,菌株HJ-5具有产生拮抗物质的能力,二者在土壤和植株上的成功定殖是防控棉花土传黄萎病的关键。接种菌株HJ-5和Gv对棉花根系分泌物的改变作用与植物系统抗性有关,这与接种菌株HJ-5和Gv之后植物防御性酶活性等特征的变化是一致的。本文的研究结果有助于研发新型棉花土传黄萎病防控技术。今后应进一步研究生物有机肥中功能菌在修复土壤障碍因子中的分子生物学机制。

全文目录

摘要  9-11
ABSTRACT  11-14
第一章文献综述  14-26
  1.1 棉花土传黄萎病概述  14-15
    1.1.1 棉花土传黄萎病的现状  14
    1.1.2 土传黄萎病的致病机理  14-15
  1.2 土传黄萎病的防控现状  15-19
    1.2.1 化学防控  15
    1.2.2 选育抗性品种  15-16
    1.2.3 田间综合防控  16
    1.2.4 生物防控  16-19
  1.3 植物土传病害生物防控的机理  19-22
    1.3.1 竞争作用  19-20
    1.3.2 拮抗作用  20-21
    1.3.3 诱导植物抗性  21
    1.3.4 促进植物生长  21-22
  1.4 菌根真菌和根际促生细菌相互作用  22-24
    1.4.1 AMF与PGPR的相互作用与机制  22-23
    1.4.2 AMF与PGPR协同改善植物营养和生长的效应  23
    1.4.3 AMF与PGPR协同抑制病原物的效应  23-24
  1.5 研究目的  24-26
    1.5.1 研究目标  24
    1.5.2 研究内容  24-25
    1.5.3 技术路线  25-26
第二章菌根真菌菌株和菌株HJ-5接种量及双接种方式的筛选  26-35
  2.1 材料与方法  26-29
    2.1.1 供试材料  26-27
    2.1.2 试验设计  27-28
    2.1.3 样品采集与测定  28-29
    2.1.4 数据分析和处理  29
  2.2 结果与分析  29-33
    2.2.1 不同浓度的HJ-5和不同种类的AMF的交互作用效果  29-32
    2.2.2 菌株HJ-5和Gv不同施用方法对土传黄萎病发病率、菌根真菌侵染率和棉花生长的影响  32
    2.2.3 菌株HJ-5和Gv的不同施用方法对棉花根际微生物的影响  32-33
  2.3 讨论  33-34
  2.4 小结  34-35
第三章菌株Gv和含HJ-5生物有机肥结合施用对连作土壤上棉花土传黄萎病的防效  35-45
  3.1 材料与方法  36-37
    3.1.1 测定供试材料  36
    3.1.2 试验设计  36-37
    3.1.3 样品采集与测定  37
    3.1.4 数据处理  37
  3.2 结果与分析  37-43
    3.2.0 菌株Gv和HJ-5在棉花根部的定殖  37-38
    3.2.1 菌株Gv和HJ-5生物有机肥结合施用对棉花生物量的影响  38-39
    3.2.2 菌株Gv和HJ-5生物有机肥结合施用对棉花植株氮磷含量的影响  39-41
    3.2.3 菌株Gv和HJ-5生物有机肥结合施用对根际土壤中微生物数量的影响  41-42
    3.2.4 菌根真菌侵染率  42
    3.2.5 AMF和BOF结合施用对棉花土传黄萎病发病指数的影响  42-43
  3.3 讨论  43-44
  3.4 小结  44-45
第四章菌株HJ-5生化特征及其对接种Gv的棉花生长的影响  45-65
  4.1 材料与方法  46-50
    4.1.1 供试材料  46
    4.1.2 试验设计  46-47
    4.1.3 样品采集与测定  47-50
    4.1.4 数据处理  50
  4.2 结果  50-62
    4.2.1 HJ-5发酵液拮抗作用检测  50-51
    4.2.2 拮抗菌株HJ-5发酵液性质研究  51-55
    4.2.3 HJ-5菌悬液Iturin和Surfactin馏分收集物对大丽轮枝菌平板抑制效果  55-57
    4.2.4 HJ-5粗提物对Gv在棉花根系定殖的影响  57
    4.2.5 HJ-5粗提物对接种Gv的棉花生物量的影响  57-58
    4.2.6 双接种菌株HJ-5和Gv对棉花根系生长的影响  58-59
    4.2.7 双接种菌株HJ-5和Gv对棉花根系活力的影响  59
    4.2.8 双接种菌株HJ-5和Gv对棉花生物量的影响  59-60
    4.2.9 双接种菌株HJ-5和Gv对棉花磷含量的影响  60
    4.2.10 双接种菌株HJ-5和Gv对棉花根际土壤中磷酸酶含量的影响  60-61
    4.2.11 双接种菌株HJ-5和Gv对棉花根内和根际土壤中HJ-5数量的影响  61-62
  4.3 讨论  62-64
  4.4 小结  64-65
第五章菌株Gv和菌株HJ-5对棉花根际土壤微生物特性的影响  65-77
  5.1 材料与方法  65-69
    5.1.1 测定供试材料  65-66
    5.1.2 试验设计  66
    5.1.3 样品采集与测定  66-68
    5.1.4 数据处理  68-69
  5.2 结果  69-75
    5.2.1 菌株HJ-5对大丽轮枝菌的平板抑制效果  69-70
    5.2.2 菌株GHJ-5和HJ-5生长曲线  70
    5.2.3 荧光显微镜观察菌株GHJ-5定殖情况  70-71
    5.2.4 生物量  71-73
    5.2.5 接种Gv和GHJ-5对根际土壤微生物结构的影响  73
    5.2.6 双接种条件下菌株GHJ-5和Gv在棉花根部的定殖  73-74
    5.2.7 棉花根际真菌和细菌的生物多样性分析  74-75
  5.3 讨论  75-76
  5.4 小结  76-77
第六章菌株Gv和HJ-5对棉花根系分泌物的改变作用  77-91
  6.1 材料与方法  77-80
    6.1.1 测定供试材料  77-78
    6.1.2 试验设计  78
    6.1.3 样品采集与测定  78-80
    6.1.4 数据处理  80
  6.2 结果  80-87
    6.2.1 不同处理对棉花生物量和菌根真菌侵染率的影响  80-81
    6.2.2 不同处理对棉花发病情况和根际土壤中微生物结构的影响  81-82
    6.2.3 不同处理的根系分泌物对大丽轮枝菌的抑制作用  82
    6.2.4 不同处理对棉花根系分泌物的影响  82-83
    6.2.5 外源酚酸对大丽轮枝菌孢子萌发的影响  83-84
    6.2.6 外源酚酸对大丽轮枝菌菌落直径的影响  84-85
    6.2.7 根盒试验中不同处理根系分泌物对大丽轮枝菌孢子萌发的影响  85-86
    6.2.8 根盒试验中不同处理棉花根系酚酸类分泌物的浓度  86-87
  6.3 讨论  87-89
  6.4 小结  89-91
第七章菌株Gv和HJ-5对棉花抗病特性的影响  91-105
  7.1 材料与方法  91-95
    7.1.1 供试材料  91-92
    7.1.2 试验设计  92
    7.1.3 样品采集与测定  92-95
    7.1.4 数据处理  95
  7.2 结果与分析  95-102
    7.2.1 不同处理对过氧化物酶活性的影响  95-96
    7.2.2 不同处理对多酚氧化酶活性的影响  96-97
    7.2.3 不同处理对苯丙氨酸解氨酶活性的影响  97
    7.2.4 不同处理对超氧化物歧化酶活性的影响  97-98
    7.2.5 不同处理对几丁质酶活性变化的影响  98-99
    7.2.6 不同处理对棉花光合速率,蒸腾速率和叶绿素含量的影响  99
    7.2.7 不同处理对植株叶片中水杨酸含量变化的影响  99-100
    7.2.8 不同处理对棉花植株茎基部导管的堵塞和胼胝质含量的影响  100-102
  7.3 讨论  102-103
  7.4 小结  103-105
参考文献  105-118
全文结论  118-119
创新点  119-120
致谢  120-121
攻读学位期间已（待）发表的论文  121

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