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四种鳞翅目害虫肠道细菌多样性分析

作　者: 杨焊
导　师: 苏建亚
学　校: 南京农业大学
专　业: 农药学
关键词: 棉铃虫稻纵卷叶螟甜菜夜蛾菜青虫 16S rRNA 肠道细菌共生防治
分类号: S433.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本研究采用传统微生物培养方法与16S rRNA基因序列分析研究相结合,对四种鳞翅目害虫幼虫：棉铃虫(Helicoverpa armigera)、稻纵卷叶螟(CInaphalocrocis medinalis)、菜青虫(Pieris rapae)和甜菜夜蛾(Spodoptera exergual)肠道中的细菌类群进行了分离与鉴定研究,共分离到47种细菌,并对其中部分肠道细菌的生理生化特性、溶血活性和对抗生素的敏感性进行了分析。1.棉铃虫幼虫肠道细菌的种类从棉铃虫幼虫肠道中分离并鉴定出21个细菌种类,属于6个纲,有α-变形菌纲(α-Proteobacteria), β-变形菌纲(β-Proteobacteria),γ-变形菌纲(y-Proteobactera),放线菌纲(Actinobacteria),鞘脂杆菌纲(Sphingobacteria),芽孢杆菌纲(Bacilli)。这些细菌分离物属于12个属,分别为芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、克雷伯菌属(Klebsiella).马赛菌属(Massilia).微杆菌属(Microbacterium)、微球菌属(Micrococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、鞘脂杆菌属(Sphingobacterium)、假平胞菌属(Sphingomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)。2.稻纵卷叶螟幼虫肠道细菌的种类25种细菌从稻纵卷叶螟幼虫的肠道中分离到,大多数属于芽孢杆菌纲(Bacilli)和γ-变形菌纲(y-Proteobactera),其余属于β-变形菌纲(β-Proteobacteria)、仅-变形菌纲(a-Proteobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)和鞘脂杆菌纲(Sphingobacteria)。这些分离细菌分别属于15个属,它们是不动杆菌属(Acinetobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短波单胞杆菌属(Brevundimonas)、伯克氏菌属(Burkholderia).肠球菌属(Enterococcus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)\哈夫尼菌属(Hafnia)、克雷伯菌属(Klebsiella)、微杆菌属(Microbacterium)、微球菌属(Micrococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、鞘脂杆菌属(Sphingobacterium)、葡萄杆菌属(Staphylococcus)、链霉菌属(Strepiomyces).3.菜青虫幼虫肠道细菌的种类共有属于4个纲14个属的18种细菌从菜青虫幼虫肠道中分离到,它们属于α-变形菌纲(α-Proteobacteria),γ-变形菌纲(γ-Proteobactera),放线菌纲(Actinobacteria),芽孢杆菌纲(Bacilli)。分别属于不动杆菌属(Acinetobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短波单胞杆菌属(Brevundimonas)、大头茶属(Gordonia)、克雷伯菌属(Klebsiella).微杆菌属(Microbacterium)、微球菌属(Micrococcus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、动性球菌属(Planococcus)、(?)单胞菌属(Pseudomonas)、嗜冷杆菌属(lsychrobacter)、假平胞菌属(Sphingomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、枝芽胞菌属(Virgibacillus)、4.甜菜夜娥幼虫肠道细菌的种类从甜菜夜蛾幼虫肠道中分离到12种细菌,大多数属于a-变形菌纲(a-Proteobactera),其他的属于γ-变形菌纲(y-Proteobactera)、放线菌纲(Actinobacteria)和芽孢杆菌纲(Bacilli)。这些分离细菌分别属于8个属,为克雷伯菌属(Klebsiella)、考克氏菌属(Kocuria)、微球菌属(Micrococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、假平胞菌属(Sphingomonas)、葡萄杆菌属(Staphylococcus)、狭长平胞菌属(Stenotrophomonas)。5.4种鳞翅目昆虫具有类似的肠道细菌类群四种昆虫肠道菌的类群非常类似,3种细菌在4种昆虫中都有发现,为克雷伯菌(Klebsiella sp.)、微球菌(Micrococcus sp.)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)。在三种昆虫肠道内都发现的肠道菌有4种,分别为芽孢杆菌(Bacillus sp.)、假单胞菌(Pseudomonas mosselii)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)与葡萄球菌(Staphylococcus踞)；在两种昆虫肠道中都共发现的肠道菌有12种,分别为鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)、铅黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)、微杆菌(Microbacterium sp)、弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)、红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)、红球菌(Rhodococcus sp.)、鞘脂杆菌(Phingobacterium sp.)、假平胞菌(Sphingomonassp.)、阿尔来葡萄球菌(Staphylococcus arlettae)与克氏葡萄球菌(Staphylococcus kloosii)。剩下的28种细菌仅在一种昆虫中分离到。6.有2种细菌首次从昆虫肠道中分离到本研究还分离到两种以前从未在昆虫肠道内分离报道的细菌,分别为蒂莫内马赛菌(Massilia timonae)和动性球菌(Planococcus sp.),蒂莫内马赛菌在棉铃虫幼虫肠道中分离到,而动性球菌在菜青虫幼虫肠道中发现。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一章文献综述  10-24
  1 昆虫肠道微生物  10-18
    1.1 昆虫肠道微生物的研究概况  10-11
    1.2 昆虫肠道微生物的多样性  11-12
    1.3 昆虫肠道微生物与昆虫的关系  12-13
      1.3.1 共栖  12
      1.3.2 互利共生  12-13
      1.3.3 寄生  13
    1.4 昆虫肠道微生物的功能  13-18
      1.4.1 为昆虫合成多种营养物质  14-15
      1.4.2 微生物的解毒作用  15
      1.4.3 参与昆虫的生殖调控  15-16
      1.4.4 对寄主的共生间接保护  16-18
  2 害虫的共生防治  18-22
    2.1 共生防治的概念  18-19
    2.2 共生防治的应用研究进展  19-22
  3 本研究目的与意义  22-24
第二章材料与方法  24-34
  1 供试昆虫  24
  2 供试幼虫解剖  24
  3 肠道细菌的分离与培养  24-25
    3.1 平板的制备  24-25
    3.2 肠道菌分离  25
    3.3 细菌分离物的纯化  25
  4 细菌分离物的16S rRNA鉴定  25-28
    4.1 16S rRNA的PCR扩增  26
    4.2 PCR扩增产物纯化  26-27
    4.3 连接  27
    4.4 转化与涂板  27
    4.5 阳性克隆筛选  27-28
    4.6 测序  28
    4.7 BLAST分析  28
    4.8 分离菌种保存  28
  5 细菌分离物的生化特性分析  28-34
    5.1 革兰氏反应  28-29
    5.2 过氧化氢酶反应  29
    5.3 碳利用特性  29
    5.4 解脂活性  29-30
    5.5 吲哚产生特性  30
    5.6 甲基红试验(M.R.试验)  30
    5.7 溶血活性测定  30-31
    5.8 抗生素敏感性测定  31-34
第三章结果与分析  34-48
  1 四种鳞翅目幼虫肠道细菌分离情况  34-35
  2 肠道细菌16S rRNA电泳条带分析  35
  3 肠道细菌16S rRNA基因同源性比对及系统发育分析  35-44
    3.1 棉铃虫幼虫肠道的细菌群落  35-36
    3.2 稻纵卷叶螟幼虫肠道的细菌群落  36-41
    3.3 菜青虫幼虫肠道的细菌群落  41-43
    3.4 甜菜夜蛾幼虫肠道的细菌群落  43-44
  4 生化特性分析  44-45
  5 溶血活性检测  45-46
  6 抗生素敏感性测定  46-48
第四章讨论  48-56
  1 鳞翅目幼虫肠道细菌的多样性  48-53
  2 鳞翅目幼虫肠道细菌的功能  53-55
  3 本研究用于共生防治的可行性分析  55-56
第五章主要结论  56-58
参考文献  58-68
致谢  68-70
攻读学位期间发表的论文  70

四种鳞翅目害虫肠道细菌多样性分析

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