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2株沙雷氏菌Serratia spp.部分生物学功能测定及发酵工艺参数的初探

作　者: 高晓星
导　师: 陈秀蓉
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 草地生物多样性
关键词: 内生菌植物内生细菌沙雷氏菌生物学功能生长激素溶磷能力抑菌机制发酵工艺参数
分类号: S182
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本文以东祁连山高寒牧草珠芽蓼茎部和线叶嵩草叶部分离筛选出的2株沙雷氏菌Z10和X4为研究对象，对其分泌吲哚乙酸(IAA)、溶磷及其机制和抑菌机制等生物学功能进行测定，并对菌株X4在10L全自动发酵罐中发酵温度、pH、通气量以及搅拌转速等工艺参数进行研究，主要获得以下结果：1.分泌吲哚乙酸IAA能力的测定采用Salkowski比色法，菌株Z10和X4分泌吲哚乙酸IAA能力的结果表明：在含色氨酸的金氏培养基中菌株Z10和X4分泌IAA的量分别为63.82mg/L、50.74mg/L，而在不含色氨酸的金氏培养基中IAA的分泌量分别是5.38mg/L、4.95mg/L。适当稀释浓度的菌液可以促进作物种子的发芽率以及幼苗株高，2菌液稀释倍数为30倍对小麦和番茄种子的发芽有一定的抑制作用。稀释倍数为40或50倍时，Z10和X4能够明显提高供试种子的发芽率。当稀释倍数为50倍时能显著促进小麦和燕麦的株高，稀释40倍的处理对番茄和紫花苜蓿也有促生效果。2.溶磷能力的测定菌株Z10和X4溶磷能力测定结果表明：在Pikovaskaia无机培养基和蒙金娜有机培养基上2供试菌株都能形成明显的溶磷圈。其中，Z10和X4在Pikovaskaia无机培养基上溶磷圈直径/菌落直径（D/d）值分别为3.16、3.23，而在蒙金娜有机培养基上，Z10和X4溶磷圈直径/菌落直径（D/d）值分别为4.0、4.31。在无机磷和有机磷培养液中，Z10和X4的有效磷增量分别为88.63mg/L、86.05mg/L和19.37mg/L、14.39mg/L，并且培养介质中pH都有所下降。溶磷机制的初探结果表明在溶解有机磷时，酶类起主要的作用，而在溶解无机磷的过程中，酸和酶类的共同作用更明显。3.对植物病原真菌抑制作用测定采用平皿对峙法测定结果表明：Z10和X4对4种供试植物病原真菌，即辣椒立枯丝核病菌（Rhizoctonia solani）；黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）；油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerntiorum)；番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）都具有抑制作用，R值的范围在0.44～0.67之间。对峙培养后显微观察病原菌菌丝生长形态异常，出现膨大扭曲现象，原生质发生凝集，菌丝顶端和中部出现泡状物，菌丝的泡状物破裂，原生质外溢，致使菌丝断裂。采用生长速率法测定结果表明：Z10和X4无菌液的抑制率与稀释浓度之间基本呈正相关。当菌株Z10的浓度为6.25μl/ml时对辣椒立枯丝核病菌的抑制作用最大，抑制率达到37.1%；浓度为100μl/ml时对辣椒立枯丝核的抑制率也最大，达到65.3%；EC50为26.6μl/ml。当X4的浓度为6.25μl/ml时对油菜菌核病菌的抑制率最大，为37.0%，EC50为42.7μl/ml；浓度为100μl/ml时对黄瓜枯萎病菌的抑制率最大，为59.5%；EC50为64.7μl/ml。通过酸沉淀法或有机溶剂萃取法，Z10和X4利用旋转蒸干仪均得到淡黄色的粗提物，菌株Z10和X4所产生的抑菌物质对热具有不稳定性，当pH范围在6～8时菌株Z10和X4的抑菌活性达到最大，紫外照射时间对2供试菌株的抑菌活性影响不明显。4.沙雷氏菌X4发酵工艺参数的研究通过对菌株X4的发酵工艺参数研究，结果表明：当发酵温度为28℃、pH7.0、通气量为1000L/h、搅拌转速为200r/min时，菌株X4的活菌数达到最大值。并在其最佳发酵工艺参数条件下培养，以发酵时间为横坐标，发酵液活菌数为纵坐标制作沙雷氏菌X4的生长曲线，其中，当发酵4h后进入对数生长期，32h进入稳定期，发酵液中活菌数最高可达到1.195×1012cfu/ml，最终可初步确定X4发酵的最适放罐时间为32～36h。

全文目录

摘要  2-4
Summary  4-7
目录  7-10
前言  10-12
文献综述  12-24
  1. 微生物功能群的研究概况  12-13
    1.1 国外研究进展  12-13
    1.2 国内研究进展  13
  2 植物内生细菌的研究概况  13-20
    2.1 内生细菌的概念  14-15
    2.2 内生细菌的生物学功能  15-19
      2.2.1 固氮作用  15-16
      2.2.2 溶磷作用  16-17
      2.2.3 促进植物的生长  17
      2.2.4 生防作用  17-19
    2.3 内生细菌在生物防治中的应用  19-20
    2.4 沙雷氏菌在植物病害防治中的应用  20
  3 微生物发酵工艺研究  20-22
    3.1 温度  21-22
    3.2 溶解氧  22
    3.3 pH  22
  4 本研究的目的与意义  22-24
第一章 2株沙雷氏菌分泌吲哚乙酸及溶磷能力的测定  24-34
  1 材料与方法  24-27
    1.1 供试材料  24-25
    1.2 内生细菌Z10和X4分泌吲哚乙酸 IAA 能力的测定  25-26
    1.3 内生细菌Z10和X4溶磷能力的测定  26
    1.4 Z10和X4菌液对种子发芽率及幼苗株高的影响  26-27
    1.5 数据处理  27
  2 结果与分析  27-32
    2.1 菌株Z10和X4分泌生长激素 IAA 的能力  27-28
    2.2 菌株Z10和X4溶磷能力的测定  28-30
    2.3 不同浓度Z10和X4菌液对种子发芽率及幼苗株高的的影响  30-32
  3 讨论  32-34
第二章沙雷氏菌Z10和X4抑菌机制研究  34-47
  1 材料与方法  34-38
    1.1 供试材料  34-35
    1.2 Z10和X4发酵原液及无菌液的制备  35
    1.3 利用生长速率法测定拮抗菌对几种植物病原菌的抑制作用  35
    1.4 拮抗菌对几种病原菌菌丝生长的影响  35-36
    1.5 菌株Z10和X4对番茄灰霉病原孢子萌发的影响  36
    1.6 拮抗菌Z10和X4抑菌物质的分离纯化  36-38
      1.6.1 拮抗菌Z10和X4发酵原液及无菌液的制备  36
      1.6.2 抑菌物质的初步定性  36
      1.6.3 抑菌物质的粗提  36-37
      1.6.4 抑菌物质的纯化  37
      1.6.5 抑菌物质的生物显影及提纯  37-38
    1.7 抑菌物质的稳定性测定  38
      1.7.1 温度对抑菌物质活性的影响  38
      1.7.2 pH值对抑菌物质活性的影响  38
      1.7.3 紫外光照时间对抑菌物质活性的影响  38
  2 结果分析  38-46
    2.1 拮抗菌Z10和X4对黄瓜枯萎病菌的抑制作用  38-40
    2.2 拮抗菌Z10和X4对4种植物病原菌菌丝生长的影响  40-41
    2.3 拮抗菌Z10和X4对番茄灰霉病原孢子萌发的影响  41-42
    2.4 拮抗菌Z10和X4发酵液抑菌物质的初步定性  42
    2.5 酸沉淀法测定结果  42-43
    2.6 有机溶剂萃取法的测定结果  43-44
    2.7 拮抗菌抑菌粗体物的硅胶薄层层析纯化  44
    2.8 抑菌物质的稳定性的测定  44-46
      2.8.1 抑菌物质的热稳定性测定结果  44-45
      2.8.2 抑菌物质的酸碱稳定性测定结果  45
      2.8.3 紫外光稳定性的测定  45-46
  3 讨论  46-47
第三章沙雷氏菌X4发酵工艺的研究  47-55
  1 材料与方法  47-49
    1.1 供试材料  47-48
    1.2 种子液的制备  48
    1.3 发酵罐操作过程  48
    1.4 5L种子罐适宜发酵时间的确定  48
    1.5 发酵工艺参数的设定  48
    1.6 10L全自动发酵罐放罐时间的确定  48-49
    1.7 统计方法  49
  2 结果与分析  49-53
    2.1 5L种子罐适宜发酵时间的确定  49-50
    2.2 发酵温度对沙雷氏菌X4生长的影响  50
    2.3 pH对沙雷氏菌X4生长的影响  50-51
    2.4 通气量对沙雷氏菌X4生长的影响  51
    2.5 搅拌转速对沙雷氏菌X4生长的影响  51-52
    2.6 沙雷氏菌X4的生长曲线  52-53
    2.7 10L全自动发酵罐放罐时间的确定  53
  3 讨论  53-55
第四章结论  55-57
参考文献  57-69
致谢  69-70
作者简介  70-71
导师简介  71-72
图版  72-75

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