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rocG基因与枯草芽孢杆菌氮代谢关系研究

作　者: 石婷
导　师: 赵学明
学　校: 天津大学
专　业: 生物化工
关键词: 枯草芽孢杆菌 rocG基因 木糖 IPTG 诱导型启动子
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


rocG基因是Bacillus subtilis基因组中编码谷氨酸脱氢酶（GlutDH）的基因,催化反应L-glutamate + H2O + NAD+=α-oxoglutarate + NH3 + NADH,而α-酮戊二酸和谷氨酸的相互转换是所有生物体内氮代谢和碳代谢重要连接点,分析rocG基因对于枯草芽孢杆菌氮代谢的影响。构建含有木糖诱导型启动子Pxyl的载体pUC18-2以及含有IPTG诱导型启动子Pspac的载体pUC18-C。载体构建过程中设计诱导型启动子替换rocG基因原启动子,在载体中插入奇霉素Spc基因,使用奇霉素作为抗性筛选。分别将载体整合到野生菌株B.subtilis 168基因组中,研究rocG基因与野生菌株B.subtilis 168的氮代谢相互关系。通过Spizizen转化以单交换方式将pUC18-2以及pUC18-C整合到野生菌株B.subtilis 168基因组中,通过PCR扩增的方式筛选转化子分别命名为168-P和168-E。对转化子的生理特性进行研究,发酵测定转化子的生长曲线、葡萄糖消耗速率和NH4+消耗速率,分析在不同诱导物诱导情况下rocG基因表达与菌株氮代谢的关系。利用M9培养基培养测定转化子生长曲线,木糖作用诱导不明显,这是因为受到葡萄糖效应抑制;不同IPTG诱导物浓度诱导效果差别不是很明显,这是由于rocG基因在低氨浓度条件下不是主要氮代谢途径。利用LB培养基培养测定转化子生长曲线,菌体生长量随不同木糖浓度增大而升高;不同IPTG诱导物浓度诱导产生明显差别,在设定的IPTG诱导物浓度范围内随诱导物浓度升高菌体量也逐渐升高。利用M9培养基培养测定转化子葡萄糖消耗速率,葡萄糖消耗速率随木糖浓度升高而降低;对于IPTG诱导来说在对数生长期IPTG浓度2.00mM葡萄糖消耗消耗速率最快,而IPTG浓度0.00mM葡萄糖消耗速率相对来说最慢。利用M9基本盐培养基发酵测定NH4+消耗速率,不同木糖诱导物浓度诱导条件下,菌株消耗NH4+曲线没有明显差异;不同IPTG诱导物浓度诱导,在处于M9低氮条件下菌株消耗NH4+曲线没有明显差异。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-7
第一章 文献综述  7-23
  1.1 代谢工程  7-12
    1.1.1 代谢工程定义  7
    1.1.2 代谢工程研究工具  7-10
    1.1.3 代谢工程应用  10-12
  1.2 枯草芽孢杆菌简介  12-16
    1.2.1 枯草芽孢杆菌宿主优缺点  13-14
    1.2.2 枯草芽孢杆菌表达系统  14-16
  1.3 枯草芽孢杆菌中氮代谢调控机理  16-17
    1.3.1 枯草芽孢杆菌中氨基同化代谢  16
    1.3.2 枯草芽孢杆菌TnrA/GlnR调节系统  16-17
  1.4 Bacillus subtilis中rocG基因及编码产物  17-21
    1.4.1 rocG基因简介  17-18
    1.4.2 rocG基因表达及调控机理  18-20
    1.4.3 rocG基因研究进展  20-21
  1.5 选题背景及研究思路  21-23
    1.5.1 选题背景  21-22
    1.5.2 技术路线与研究内容  22-23
第二章 材料方法  23-36
  2.1 实验材料  23-29
    2.1.1 质粒与菌种  23
    2.1.2 实验仪器  23-24
    2.1.3 实验试剂  24-26
    2.1.4 培养基  26-27
    2.1.5 主要溶液  27-29
  2.2 实验方法  29-36
    2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化  29
    2.2.2 大肠杆菌质粒的提取  29-30
    2.2.3 DNA片段的切胶回收纯化  30-31
    2.2.4 PCR反应体系  31-32
    2.2.5 PCR-DNA片段纯化  32
    2.2.6 酶切体系  32
    2.2.7 内切酶的失活  32-33
    2.2.8 质粒DNA的去磷酸化  33
    2.2.9 连接体系的建立  33
    2.2.10 3’凹端的补平  33-34
    2.2.11 琼脂糖凝胶电泳  34
    2.2.12 枯草芽孢杆菌Spizizen转化  34
    2.2.13 枯草芽孢杆菌染色体DNA的提取  34
    2.2.14 利用α互补筛选目的转化子  34-35
    2.2.15 菌落PCR  35
    2.2.16 铵根离子测定  35
    2.2.17 引物设计  35-36
第三章 结果与讨论  36-60
  3.1 菌株168-P的构建  38-44
    3.1.1 rocG基因PCR扩增与酶切鉴定  38-39
    3.1.2 pSG1192-rocG质粒的构建  39
    3.1.3 pUC18-1 质粒的构建  39-41
    3.1.4 A片段PCR扩增与酶切鉴定  41
    3.1.5 pUC18-2 质粒的构建  41-42
    3.1.6 168-F的构建  42-44
  3.2 菌株168-E的构建  44-52
    3.2.1 rocG基因PCR扩增与酶切鉴定  44-46
    3.2.2 ECE149-rocG质粒的构建  46-47
    3.2.3 pUC18-A质粒的构建  47-48
    3.2.4 Spc基因PCR扩增与酶切鉴定  48-49
    3.2.5 pUC18-B质粒的构建  49
    3.2.6 B片段PCR扩增与酶切鉴定  49-50
    3.2.7 pUC18-C质粒的构建  50-51
    3.2.8 168-E的构建  51-52
  3.3 工程菌的发酵试验  52-60
    3.3.1 菌株168-P摇瓶发酵试验  52-56
    3.3.2 菌株168-E摇瓶发酵试验  56-60
第四章 结论与展望  60-62
  4.1 结论  60-61
  4.2 展望  61-62
第五章 参考文献  62-69
发表论文和参加科研情况说明  69-70
致谢  70

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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