学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌双重实时PCR法的建立

作　者: 赵燕丽
导　师: 李继昌
学　校: 东北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 单增李斯特菌金黄色葡萄球菌肉双重实时PCR
分类号: TS251.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 103次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

食源性致病菌是引起食源性疾病的主要原因,对人类健康危害很大,其中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌是两种常见的致病菌。单增李斯特菌可引起败血症、脑炎、脑膜炎、脓肿及孕妇流产等一系列食源性李斯特菌病,病死率高达30%～70%。由于该菌在4℃冰箱保存的食物中也可生长繁殖,故其危害性进一步增大。金黄色葡萄球菌是引起食源性葡萄球菌病最常见种类,可引起呕吐、腹泻等临床症状。两种菌在自然界均广泛存在,人们食用的肉、奶、蛋、水产品和蔬菜常受到这两种菌不同程度的污染,其中以肉和肉制品污染最为严重。因此,建立肉中这两种致病菌的快速、可靠的检测方法具有重要的实际意义。荧光定量PCR技术融汇了PCR的高效扩增、核酸探针杂交技术的高特异性和光谱技术的高精确性定量的优点。根据荧光定量PCR仪多通道的激发光源,可达到同时检测多种细菌的目的。目前为止还未见运用荧光定量PCR技术同时检测肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的报道,故本试验对肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR检测方法进行研究,以期能够快速、准确的检测肉中这两种致病菌,从而达到预防和控制由这两种菌引起的疾病的目的。以单增李斯特菌hlyA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因为靶基因,分别设计一对引物和一条‘TaqMan探针,在构建阳性重组质粒的基础上,分别建立基于TaqMan探针的检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的单一荧光定量PCR方法,并分析其特异性、敏感性和重复性。特异性结果显示,对于单增李斯特菌荧光定量PCR方法,10株单增李斯特菌均产生S型扩增曲线,其它6株非单增李斯特菌均不产生扩增曲线;对于金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR方法,5株金黄色葡萄球菌均产生S型扩增曲线,其它6株非金黄色葡萄球菌均不产生扩增曲线。敏感性结果显示,建立的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的标准曲线相关系数分别为0.998(R2=0.998)和0.997(R2=0.997),敏感性分别为39和37.4拷贝数。重复性试验结果显示,建立的单增李斯特菌荧光定量PCR方法和金黄色葡萄球菌荧光定量PCR方法组内变异系数均小于1%,组间变异系数均小于2%。在单一荧光定量PCR方法的基础上,建立单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR方法,分析两者的交叉反应,并制作标准曲线分析方法的敏感性。结果表明,单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌两者在建立的双重荧光定量PCR方法中互不影响各自的扩增效率,两条标准曲线相关系数均在0.99以上,该法检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的敏感性分别为19.5拷贝/μL和18.7拷贝/μL。将建立的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌双重荧光定量PCR方法应用到人工模拟肉样的检测,确定这两种致病菌在人工模拟肉样中的最低检测限,建立肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR检测方法。结果表明,建立的肉中这两种致病菌的双重荧光定量PCR方法的标准曲线在106～101cfu/mL范围内相关性良好,最低检测限均为10cfu/mL。包括基因组提取在内的整个检测过程只需约3个小时,建立的方法可用于肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的同步、快速、定量、准确、敏感检测。采用建立的肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR方法对哈尔滨100份市售生肉样品进行单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的检测,并与传统培养法进行比较。结果表明,荧光定量PCR法对单增李斯特菌的检出率为7%,对金黄色葡萄球菌的检出率为6%,高于传统培养法对单增李斯特菌3%的检出率和对金黄色葡萄球菌3%的检出率。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
1 引言  12-23
  1.1 单增李斯特菌研究现状  12-13
    1.1.1 单增李斯特菌生物学特征  12-13
    1.1.2 单增李斯特菌流行病学  13
    1.1.3 单增李斯特菌的致病因子  13
  1.2 金黄色葡萄球菌研究现状  13-15
    1.2.1 金黄色葡萄球菌生物学特性  14
    1.2.2 金黄色葡萄球菌流行病学  14
    1.2.3 金黄色葡萄球菌致病因子  14-15
  1.3 两种食源性致病菌的检测方法研究进展  15-21
    1.3.1 传统的分离鉴定  15
    1.3.2 显色培养基鉴定方法  15-16
    1.3.3 免疫学检测方法  16-17
    1.3.4 分子生物学检测方法  17-21
  1.4 本研究的目的和意义  21-23
2 材料与方法  23-35
  2.1 试验材料  23-24
    2.1.1 菌种  23
    2.1.2 试剂  23
    2.1.3 溶液的配置  23-24
    2.1.4 主要仪器与设备  24
  2.2 试验方法  24-35
    2.2.1 单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌单一荧光定量PCR方法的建立  24-29
    2.2.2 单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌双重荧光定量PCR方法的建立  29-31
    2.2.3 肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌双重荧光定量PCR方法的建立  31-33
    2.2.4 市售生肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的污染情况检测  33-35
3 结果  35-48
  3.1 单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌单一荧光定量PCR方法的建立  35-43
    3.1.1 阳性质粒的制备  35-38
    3.1.2 单增李斯特菌荧光定量PCR方法建立  38-40
    3.1.3 金黄色葡萄球菌荧光定量PCR方法建立  40-42
    3.1.4 稳定性试验结果  42-43
  3.2 单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌双重荧光定量PCR方法的建立  43-45
    3.2.1 双重荧光定量PCR干扰试验  43
    3.2.2 双重荧光定量PCR的标准曲线及敏感性分析  43-45
  3.3 肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌双重荧光定量PCR方法的建立  45-47
    3.3.1 人工模拟肉样中细菌基因组DNA提取方法的比较  45-46
    3.3.2 人工模拟肉样中两种致病菌的双重荧光定量PCR检测方法的敏感性分析  46-47
    3.3.3 人工模拟肉样中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的定量检测  47
  3.4 市售生肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的污染情况  47-48
4 讨论  48-52
  4.1 靶基因的选择  48
  4.2 引物和探针的设计  48-49
  4.3 肉样中DNA模板不同提取方法比较  49
  4.4 肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌双重荧光定量PCR检测方法的建立  49-50
  4.5 荧光定量PCR方法对实际样品的检测  50
  4.6 荧光定量PCR污染的防控  50-52
5 结论  52-53
致谢  53-54
参考文献  54-60
攻读硕士期间发表的学术论文  60

肉中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌双重实时PCR法的建立

内容摘要

全文目录

相似论文