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琼胶糖降解菌的鉴定和选育及其发酵产物的研究

作　者: 张竹琳
导　师: 陆兆新
学　校: 南京农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 琼脂糖琼脂糖降解菌假别单胞菌发酵优化制备
分类号: TS202.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

琼胶被公认为是一种安全的食品添加剂。琼胶来源的寡糖包括琼胶寡糖(agaro-oligosaccharides, AOS)和新琼寡糖(neoagaro-oligosaccharides, NAOS),是一类新型的海洋功能性低聚糖。琼胶寡糖的生物活性正在逐渐被挖掘,不仅具有功能性低聚糖的一般特性,还具有许多普通寡糖无法替代的生理功能特性,如抑菌作用、增殖肠道益生菌作用、抗氧化作用、抗病毒作用、抗炎作用、抗龋齿及抗淀粉老化等多方面生物活性,对黑素瘤细胞有增湿美白作用。因此,琼胶低聚糖在食品、化妆、医药等行业具有很大的潜在应用价值。迄今为止,实现了产业化生产的只有从大西洋假单孢菌(Pseudomonas atlantica)中分离的p-琼胶酶,并且价格昂贵,应用范围也仅限于科研工作,大大阻碍了琼胶酶及琼胶低聚糖的开发应用,因而对琼胶酶的研究具有极其重要的意义。本论文主要对高活性的琼脂糖降解菌的筛选鉴定、琼脂糖降解菌的诱变育种、琼脂糖降解菌发酵条件的优化、假别单胞菌fmb-A18细胞制备琼胶寡糖进行了研究,旨在为琼胶低聚糖的生产和应用奠定基础。主要研究结果分述如下：1.从海水中分离筛选得到了琼脂糖降解菌并对其进行鉴定。采用人工海水培养基初筛、摇瓶复筛的筛选策略,从连云港近海海水中分离筛选到一株具有琼胶酶活性的菌株fmb-A17,其琼胶酶活为4.5U/mL。通过对其形态特征、生理生化特征进行鉴定,初步判定该菌株为假别单胞菌Pseudoalteromonas。采用细菌16S rDNA序列的通用引物对菌株fmb-A17进行PCR扩增,获得1147bp的片段。将该PCR产物在GenBank数据库中BLAST软件进行同源搜索比对,利用Clustal Ⅹ1.83和MEGA4.0软件进行多重比较后绘制系统发育树,结果表明：菌株fmb-A17的16S rDNA序列与假别单胞菌Pseudoalteromonas sp. BSs20060的16S rDNA序列同源性达99%；在系统发育树中,菌株fmb-A17与P. tunitaca在同一分支,亲缘关系最近。结合常规形态特征、生理生化特征,鉴定该菌株为假别单胞菌Pseudoalteromonas。2.琼脂糖降解菌fmb-A17的诱变育种。采用了NTG、EMS、LiCl和低能氮离子束注入等四种诱变方法同时对Pseudoaltermonas sp. fmb-A17进行诱变,确定了最佳的诱变条件。结果表明,NTG诱变的最佳浓度是10μg/mL, EMS的最佳浓度是0.07mol/mL, LiCl的最佳浓度是1%,在10kev能量下,选择氮离子注入时间为10s。最终,获得突变株fmb-A18酶活为7.38U/mL,且遗传性状稳定。3.琼脂糖降解菌突变株fmb-A18的发酵条件优化。先后通过单因素实验、Plackett-Burma设计以及响应曲面设计,确定菌株finb-A18发酵产酶的最佳条件。结果表明：单因素实验的最佳条件为,培养温度28℃、转速180rpm、装液量50mL、接种量10%、发酵时间24h,琼脂粉0.2%、酵母粉0.1%、麦芽糖0.1%、柠檬酸三铵0.1%、MgSO4·7H2O0.5%、KC11mmol/L、K2HPO4100μmol/L、CaCl2100μmol/L、 FeSO4.7H21μmol/L; PB设计筛选得到的发酵培养基的关键因子为酵母粉、麦芽糖和KCl,并确定响应曲面的中心点为：酵母粉0.24%、麦芽糖0.2%、KC11mmol/L;响应曲面法设计确定了最终培养基的最优组合为麦芽糖1.706g/L、酵母粉1.174g/L、 KC11.021mmol/L、NaCl40g/L、FeSO40.5pmol/L、K2HPO4100μmol/L、柠檬酸三铵1g/L、MgSO45g/L、琼脂粉2.4g/L,在此发酵条件下,菌株fmb-A18发酵上清的酶活可达到15.044U/mL,比原始培养条件提高了103.85%。4.假别单胞菌finb-A18细胞制备琼胶寡糖。通过对琼脂糖、酵母粉、柠檬酸三铵、MgSO4、NaCk、发酵时间等因素对Pseudoalteromonas sp. fmb-A18细胞转化法生产琼胶寡糖的影响进行了考察和分析,其发酵上清液经离心除菌,75%乙醇沉淀,通过大孔树脂NAK-II静态及动态吸附、DEAE-Sephcel阴离子交换层析、HiTrapTM esalting脱盐层析和Sephadex G15葡聚糖凝胶层析,获得HPLC为单一峰的琼胶寡糖,并对其进行了鉴定。结果表明：由单因素实验获得的Pseudoalteromonas sp. fmb-A18细胞转化法生产琼胶寡糖的反应最佳体系为,琼脂糖浓度为0.4%、酵母粉浓度为20g/L、柠檬酸三铵浓度为8g/L、MgSO4的浓度为2g/L、NaCl的浓度为6g/L,发酵60h,在此条件下测得发酵上清液的总糖含量为5mg/mL;大孔树脂静态吸附实验中,七种大孔树脂中NAK-Ⅱ对琼胶寡糖的处理效果最佳,在最佳的静态吸附条件下(pH值10.0、温度40℃、吸附时间1811),NAK-Ⅱ树脂对粗寡糖溶液的蛋白清除率和寡糖残留率分别为70-85%和75-80%；大孔树脂NAK-Ⅱ动态吸附实验的结果表明,在最佳的动态吸附实验条件下(流速1mL/min、5mg/mL的粗寡糖溶液),NAK-Ⅱ树脂对粗寡糖溶液的蛋白清除率和寡糖残留率最高达到80%,最低为65%；大孔树脂处理后的粗寡糖样品经DEAE-Sephcel阴离子交换、HiTrapTM Desalting脱盐和Sephadex G15葡聚糖柱层析后得到纯度为91.36%的寡糖组分GA-1,经高效液相色谱分析得GA-1是一个四糖单位的寡糖。

全文目录

表格索引  7-9
图形索引  9-13
摘要  13-15
ABSTRACT  15-18
缩写符号  18-19
第一章文献综述  19-43
  1 琼胶酶的研究进展  19-28
    1.1 琼胶酶的来源与分类  20-21
    1.2 琼胶酶的家族分类  21-22
    1.3 琼胶酶活力的测定方法  22-23
    1.4 琼胶酶酶学性质  23-26
    1.5 琼胶酶的基因序列分析  26-28
    1.6 琼胶酶的应用  28
  2 琼胶寡糖的研究进展  28-33
    2.1 琼胶低聚糖的制备  29
    2.2 琼胶低聚糖的分离纯化  29-31
    2.3 定性及定量的方法  31-32
    2.4 琼胶寡糖生物活性作用  32-33
  3 研究目的、意义及内容  33-35
  参考文献  35-43
第二章琼胶糖降解菌的分离筛选及鉴定  43-59
  1 材料与方法  43-46
    1.1 材料  43-44
    1.2 方法  44-46
  2 结果与分析  46-53
    2.1 琼胶糖降解菌的分离筛选  46-47
    2.2 菌种鉴定  47-51
    2.3 BLAST同源性搜索与系统发育树的绘制  51-53
  3 讨论  53-54
  4 本章小结  54-55
  参考文献  55-59
第三章假别单胞菌fmb-A17的诱变育种  59-69
  1 材料与方法  59-61
    1.1 材料  59-60
    1.2 方法  60-61
  2 结果与分析  61-65
    2.1 化学诱变效果评价  61-63
    2.2 低能氮离子束注入诱变  63-64
    2.3 遗传稳定性试验  64-65
  3 讨论  65-66
  4 本章小结  66-67
  参考文献  67-69
第四章假别单胞菌fmb-A18发酵条件优化  69-89
  1 材料与方法  69-72
    1.1 材料  69-70
    1.2 方法  70-72
  2 结果分析  72-84
    2.1 菌株fmb-A17生长曲线与产酶曲线的测定  72-73
    2.2 单因素实验  73-78
    2.3 发酵条件关键因子的筛选——Placker Burman Design  78-80
    2.4 响应面法优化琼胶酶发酵条件  80-84
  3 讨论  84-85
  4 本章小结  85-86
  参考文献  86-89
第五章假别单胞菌fmb-A18制备琼胶寡糖  89-109
  1 材料与方法  89-94
    1.1 材料  89-90
    1.2 方法  90-94
  2 结果与分析  94-103
    2.1 反应体系条件  94-96
    2.2 琼胶寡糖的分离纯化  96-102
    2.3 寡糖组分GA-1的纯度测定  102-103
  3 讨论  103-104
  4 本章小结  104-106
  参考文献  106-109
全文结论  109-111
论文创新点  111-113
致谢  113

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