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环境响应型肝靶向纳米凝胶给药系统研究

作　者: 段存贤
导　师: 张典瑞; 王凤山
学　校: 山东大学
专　业: 药剂学
关键词: 冬凌草甲素壳聚糖 N-异丙基丙烯酰胺 pH敏感纳米凝胶半乳糖肝癌靶向组织分布药代动力学体内抗肿瘤活性
分类号: R943
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本课题首先合成了环境响应型壳聚糖聚合物,并首次将此聚合物与乳糖酸缩合制备具有肝细胞靶向作用的半乳糖化壳聚糖材料。以冬凌草甲素(Oridonin, ORI)为模型药物,采用自组装法制备半乳糖化及未半乳糖化的冬凌草甲素纳米凝胶制剂,并对上述两种纳米制剂的体内外抗肿瘤活性进行考察,为肝癌靶向制剂的开发提供理论和实验依据。主要研究内容及结果如下：1.壳聚糖-g-聚(N-异丙基丙烯酰胺)纳米凝胶作为药物载体的研究以壳聚糖和N-异丙基丙烯酰胺为原料,采用自由基聚合法制备具有环境pH响应特性的壳聚糖-g-聚(N-异丙基丙烯酰胺)(CS-g-PNIPAm),并采用FTIR,1H-NMR和XRD等方法对该聚合物结构进行确证。以ORI为模型药物,采用自组装法制备载药纳米凝胶(ORI-CS-NG),并考察各种制备条件对纳米凝胶中药物包封率的影响；结果表明,ORI-CS-NG中药物包封率受到载体材料用量和载体聚合物制备条件的影响。透射电镜和激光光散射分析显示ORI-CS-NG为类球形、表面光滑圆整、粒径分布窄、平均粒径在100nm左右。ORI-CS-NG的XRD分析结果表明ORI在纳米凝胶中以分子、微晶或无定形状态存在。以透析法考察ORI-CS-NG中ORI的体外释放行为,结果表明制剂中药物的释放具有明显的pH敏感特性：在pH7.4的释放介质中,12h的药物累积释放量低于50%；而在弱酸性的释放介质中(pH6.5、6.0和5.0),12h时药物累积释放量超过80%。采用MTT比色法考察空白纳米凝胶(CS-NG)及ORI-CS-NG对人肝癌HepG2细胞的细胞毒作用。结果表明CS-NG无明显的细胞毒性,而ORI-CS-NG对HepG2细胞的抗肿瘤活性随药物浓度的增加和作用时间的延长而增强；ORI(?)(?)ORI-CS-NG对HepG2细胞的细胞毒作用均具有pH敏感特性,在弱酸性条件下这两种制剂的抗肿瘤活性增强；且ORI-CS-NG的抗肝癌活性明显高于ORI。 ORI-CS-NG在pH7.4和6.5时对HepG2细胞的IC50值分别为13.18(?)(?)8.86μg/mL,而ORI在pH7.4和6.5时的IC50值分别为16.94和12.00μg/mL。对HepG2细胞形态考察结果表明CS-NG无明显的细胞毒性,而ORI-CS-NG可显著提高ORI体外对HepG2的抗肿瘤活性。2.半乳糖化壳聚糖-g-聚(N-异丙基丙烯酰胺)纳米凝胶作为药物载体的研究利用壳聚糖结构中的氨基和乳糖酸结构中的羧基在EDC作用下进行缩合,制备半乳糖化壳聚糖-g-聚(N-异丙基丙烯酰胺)(Gal-CS-g-PNIPAm)聚合物,采用FTIR、1H-NMR和XRD等方法对该产物的结构进行表征。Gal-CS-g-PNIPAm中半乳糖的取代度采用1H-NMR进行测定,结果表明随着反应体系中乳糖酸用量的增加,Gal-CS-g-PNIPAm中半乳糖的取代度先增加后降低。选择取代度分别为7.26%,11.95%和14.06%的Gal-CS-g-PNIPAm作为载体进行实验,采用自组装法制备冬凌草甲素Gal-CS-g-PNIPAm(?)内米凝胶(ORI-GC-NG),三种载药纳米凝胶均为类球形,表面光滑,粒径分布均匀,平均粒径在200nm左右。随着聚合物中半乳糖取代度的增加,ORI-GC-NG中药物包封率与Z-电位均逐渐降低。对ORI-GC-NG的XRD分析结果说明ORI在此三种纳米凝胶制剂中均以分子、微晶或无定形状态存在。以透析法测定上述三种ORI-GC-NG中ORI的体外释放行为,结果表明ORI-GC-NG中药物的释放均具有pH敏感的特性,随着释放介质pH的降低,释药速率增加。采用MTT法分别考察空白Gal-CS-g-PNIPAm纳米凝胶(GC-NG)及三种ORI-GC-NG在不同pH条件下对HepG2和人乳腺癌MCF-7细胞的细胞毒作用,结果表明GC-NG对这两种肿瘤细胞均无明显的毒性；ORI-GC-NG中随着药物浓度的增加,两种肿瘤细胞的存活率均降低；pH相同时ORI-GC-NG对HepG2和MCF-7细胞的抗肿瘤活性比ORI强。ORI-GC-NG的抗肿瘤活性具有明显的pH敏感特性,对HepG2的细胞毒作用随着pH的增加而降低,而对MCF-7细胞体外生长的抑制作用随着pH的增加而增加；pH7.4时,ORI-GC-NG对HepG2和MCF-7细胞的抗肿瘤作用均高于ORI-CS-NG;而在pH6.5时,ORI-GC-NG对HepG2G勺增殖抑制效果要显著高于ORI-CS-NG,但对MCF-7细胞的抑制作用要明显低于ORI-CS-NG。3.冬凌草甲素纳米凝胶组织分布、药动学及其体内抗肿瘤作用研究以ORI为对照,研究了半乳糖化及未半乳糖化的载药纳米凝胶制剂(ORI-GC-NG和ORI-CS-NG)尾静脉注射后在正常及荷瘤小鼠体内各主要组织、器官中的经时变化规律和分布情况,及其对荷肝癌H22小鼠的抑瘤效果。结果表明,在正常小鼠体内,ORI-CS-NG的相对摄取率从高到低依次为肝3.260、血1.914、脾1.294、肺1.112、心0.879和肾0.489；GCN-3(半乳糖取代度为14.06%的ORI-GC-NG)的相对摄取率依次排列为肝6.335、血3.639、脾1.083、心0.992、肺0.727和肾0.434。而在荷瘤小鼠体内,ORI-CS-NG的相对摄取率从高到低依次为肝2.538、肿瘤2.280、血2.106、脾1.27I、肺1.212、肾0.706和心0.518；GCN-3的相对摄取率依次排列为肿瘤5.672、肝4.171、血2.966、脾1.038、肾0.790、肺0.779和心O.708.GCN-3和ORI-CS-NG均具有明显的肿瘤靶向性,而GCN-3肿瘤靶向效果更佳。荷瘤小鼠尾静脉注射ORI、ORI-CS-NG和GCN-3后血药浓度-时间曲线均符合二室模型。ORI的主要药动学参数为：半衰期t12α=0.721h,t1/2β=6.806h,血药浓度-时间曲线下面积AUC0～∞=18.112(h·μg/mL),清除率CLs=0.442(mg/kg/h/(μg/mL))；ORI-CS-NG的主要药动学参数为：半衰期t1/2α=3.273h,t1/2β=69.315h,血药浓度-时间曲线下面积AUC0～∞=21.721(h·μd/mL),清除率CLs=0.243(mg/kg/h/(μd/mL))；GCN-3的主要药动学参数为：半衰期t1,2α=3.755h,t1/2β=69.315h,血药浓度-时间曲线下面积AUC0～∞=46.373(h·μd/mL),清除率CLs=0.171(mg/kg/h/(μg/mL))。由结果可知,上述两种载药纳米凝胶可以显著延长药物ORI在体内的消除半衰期t1/2β,明显增加AUC,降低药物体内清除率。采用动物移植性肿瘤的实验方法,将小鼠肝癌H22细胞接种于昆明种小鼠皮下,进行体内抑瘤实验；结果表明,在相同药物剂量时,ORI的抗肿瘤活性最差,ORI-CS-NG和GCN-3的抑瘤率均有所提高,且GCN-3的抑瘤效果更强。在给药量为8mg/(kg·d)(?)寸,ORI、ORI-CS-NG和GCN-3的抑瘤率分别为32.16%、51.80和70.76%,且此三种制剂的体内毒性均较小。本研究选用具有环境pH响应型智能聚合物材料作为抗肿瘤药物冬凌草甲素的载体,首次将具有肝靶向性的半乳糖基团链接在载体材料中,得到同时具备pH敏感和主动靶向这两种特性的纳米凝胶给药输送体系,以实现抗肿瘤药物冬凌草甲素的肝癌靶向输送。本文的研究成果为肝癌靶向给药新剂型的开发提供了思路,并为药物冬凌草甲素的进一步临床治疗应用提供了实验和理论依据。

全文目录

中文摘要  13-17
Abstract  17-21
符号说明  21-23
前言  23-43
第一章壳聚糖-g-聚(N-异丙基丙烯酰胺)纳米凝胶作为药物载体的研究  43-77
  一、材料与仪器  43
    1. 实验材料  43
    2. 实验仪器  43
  二、实验方法与结果  43-74
    1. CS-g-PNIPAm纳米凝胶的制备  43-47
      1.1 CS-g-PNIPAm的合成和结构表征  43-46
      1.2 CS-g-PNIPAm纳米凝胶的制备  46-47
    2. 冬凌草甲素含量测定方法的建立  47-52
      2.1 标准溶液的制备  47
      2.2 检测波长的确定  47
      2.3 色谱条件  47-48
      2.4 专属性试验  48-49
      2.5 ORI标准曲线的绘制  49
      2.6 精密度试验  49-50
      2.7 回收率试验  50-52
      2.8 纳米凝胶载体中冬凌草甲素的含量测定  52
    3. 包封率测定方法的建立  52-55
      3.1 超滤回收率  53-54
      3.2 ORI-CS-NG的包封率和载药量  54-55
    4. 冬凌草甲素纳米凝胶的制备工艺考察  55-62
      4.1 制备方法的选择  55
      4.2 制备方法对ORI-CS-NG包封率的影响  55-56
      4.3 单因素考察冬凌草甲素纳米凝胶的处方与工艺  56-59
      4.4 ORI-CS-NG优化处方的验证及质量评价  59-62
    5. ORI-CS-NG体外释放  62-67
      5.1 色谱条件  62
      5.2 标准曲线  62-63
      5.3 精密度试验  63-64
      5.4 回收率  64
      5.5 ORI-CS-NG体外释药特性研究  64-67
    6. ORI-CS-NG体外抗肿瘤活性研究  67-74
      6.1 材料与仪器  67
      6.2 实验方法与结果  67-74
  三、讨论  74-77
第二章半乳糖化壳聚糖-g-聚(N-异丙基丙烯酰胺)纳米凝胶给药系统研究  77-95
  一、纳米凝胶聚合物的合成  77-81
    1. 原料与试剂  77
    2. 仪器  77
    3. Gal-CS-g-PNIPAm的合成  77-78
    4. Gal-CS-g-PNIPAm的~1H-NMR  78-79
    5. Gal-CS-g-PNIPAm的红外光谱测定  79-80
    6. 不同半乳糖化Gal-CS-g-PNIPAm的制备  80-81
  二、ORI-GC-NG的制备与表征  81-86
    1. 原料与试剂  81
    2. 仪器  81-82
    3 不同半乳糖化含药纳米凝胶的研究  82-85
      3.1 ORI-GC-NG的制备  82
      3.2 ORI-GC-NG的质量评价  82-85
    4. 体外释放  85-86
  三、ORI-GC-NG体外抗肿瘤活性研究  86-90
    1 材料与仪器  86
      1.1 材料  86
      1.2 仪器  86
    2 实验方法与结果  86-90
      2.1 细胞培养  86-87
      2.2 GC-NG的细胞毒性试验  87-88
      2.3 载药纳米凝胶的抗肿瘤活性实验  88-90
  四、讨论  90-95
第三章冬凌草甲素纳米凝胶组织分布、药动学及其抗肿瘤作用研究  95-132
  一、材料与方法  95
    1. 实验材料  95
    2. 动物  95
    3. 实验仪器  95
  二、实验方法  95-128
    1. 荷肝癌H22小鼠的制备  95-96
    2. 小鼠体内组织分布实验  96
      2.1 实验分组  96
      2.2 取材方法  96
      2.3 生物样品的处理  96
      2.4 数据处理  96
    3. 色谱条件  96-106
      3.1 方法专属性实验  97-100
      3.2 药物标准储备液的配制  100
      3.3 标准曲线的建立  100-102
      3.4 精密度实验  102-104
      3.5 回收率实验  104-106
    4. 体内分布研究  106-122
      4.1 正常小鼠体组织内分布测定结果  106-109
      4.2 荷瘤小鼠体内组织分布测定结果  109-112
      4.3 体内分布特点  112-117
      4.4 靶向性评价  117-122
    5 药代动力学研究  122-126
    6 对荷肝癌H22小鼠的体内抑瘤实验  126-128
      6.1 实验材料及动物  126-127
      6.2 实验方法与结果  127-128
  三. 讨论  128-132
全文结论  132-135
参考文献  135-146
致谢  146-147
攻读学位期间发表论文目录  147-148
学位论文评阅及答辩情况表  148

环境响应型肝靶向纳米凝胶给药系统研究

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