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拟南芥中与非生物胁迫相关基因UGT-LIKE、UF1和UF2的初步研究

作　者: 刘兆华
导　师: 王秀玲
学　校: 山东农业大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 拟南芥非生物胁迫脱落酸微丝
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

非生物逆境（包括高温、低温、干旱、盐碱等）影响植物的生长发育，是制约农作物产量和质量提高的主要因素之一。鉴定与植物耐受非生物逆境相关基因的功能，不仅可以揭示植物耐受胁迫的分子机理，还可为通过基因工程途径提高作物耐受非生物胁迫的能力提供理论基础。本研究以拟南芥为材料，利用分子生物学和细胞生物学的方法，对UGT-LIKE、AtUF1和AtUF2基因的时空表达、编码蛋白的亚细胞定位、突变体和超表达转基因拟南芥植株的表型进行了分析，并对它们与微丝骨架动态的关系进行了初步的研究。（1）UGT-LIKE的表达受微丝骨架动态和非生物胁迫诱导。利用微丝骨架聚合抑制剂（20μM Lat B处理2h和4h）和促微丝聚合剂（0.5μM JAS处理4h）处理野生型拟南芥，UGT-LIKE表达量明显升高。150mM NaCl、375mM甘露醇处理12h后该基因的表达量也明显升高。在含有0.3μM Lat B的MS培养基上光照和黑暗条件下生长12d后，超表达UGT-LIKE的拟南芥转基因植株根明显比野生型的短，并且叶片表皮细胞内的微丝束发生断裂、解聚。这些结果表明UGT-LIKE参与拟南芥对盐害和脱水胁迫的响应，并且与拟南芥微丝骨架的动态调节有关。（2）AtUF1的表达受盐、渗透胁迫、ABA和微丝动态的调节。经150mM NaCl和375mM甘露醇处理野生型拟南芥12h后，AtUF1表达量明显升高。10μM和100μM的ABA处理3h后，该基因的表达量明显升高。经20μM Lat B处理2h和4h后，AtUF1的表达量升高。此外，经10μM（6h）、100μM（2h）、2mM（2h）环己酰亚胺处理，AtUF1的表达量分别提高了13倍、15倍和67倍，这一结果暗示该基因的表达可能受负调控因子调控。在含有150mM NaCl的MS培养基上，超表达转基因拟南芥种子萌发速率高于野生型和突变体（atuf1）。在含有1.6μMABA的MS培养基上生长13d后，超表达转AtUF1基因拟南芥植株的根明显比野生型长，突变体植株的根短于野生型。推测AtUF1参与拟南芥对盐胁迫的响应过程可能和激素ABA有关。在含有0.3μM Lat B的MS培养基上生长12d后，AtUF1超表达拟南芥植株和T-DNA插入的突变体根长表现出明显的差异，超表达植株根长度明显短于野生型，突变体根长于野生型拟南芥。并且超表达转基因拟南芥植株叶片表皮细胞内微丝解聚明显，表明AtUF1可能通过调控微丝骨架的动态调节组织生长。（3）AtUF2的表达同样受盐和渗透胁迫诱导。150mM NaCl和375mM甘露醇处理野生型拟南芥12h后，该基因的表达量明显升高。利用GFP融合蛋白技术和瞬时表达方法，发现该蛋白定位于过氧化物酶体上。在含0.5μM MV的MS培养基上生长11d，超表达转基因拟南芥植株生长好于野生型和突变体，说明AtUF2可能参与拟南芥对氧化胁迫的适应。

全文目录

中文摘要  8-10
Abstract  10-12
1 前言  12-29
  1.1 非生物胁迫  12
  1.2 盐胁迫  12-15
    1.2.1 盐胁迫对植物的影响  13-14
    1.2.2 植物对盐胁迫的适应机制  14-15
  1.3 干旱胁迫  15-18
    1.3.1 干旱胁迫影响植物生长发育及生理代谢  16-17
    1.3.2 植物对干旱胁迫的适应机制  17-18
  1.4 氧化胁迫  18-19
  1.5 植物对非生物胁迫的抗逆机制  19-25
    1.5.1 一般信号通路  20-21
    1.5.2 早期基因和延迟基因的表达  21-22
    1.5.3 SOS 途径  22-23
    1.5.4 胁迫条件下的信号通路  23
    1.5.5 ABA 与非生物胁迫  23-25
  1.6 过氧化物酶体  25-26
    1.6.1 过氧化物酶体的功能  25
    1.6.2 过氧化物酶体蛋白的输入  25-26
  1.7 微丝与拟南芥抗逆  26-28
    1.7.1 微丝的结构与功能  26-27
    1.7.2 微丝的动态变化与拟南芥抗逆  27-28
  1.8 本实验的目的意义  28-29
2 材料与方法  29-44
  2.1 实验材料  29
    2.1.1 植物材料  29
    2.1.2 菌株和质粒  29
    2.1.3 酶与各种生化试剂  29
  2.2 实验方法  29-44
    2.2.1 植物基因组的提取  29-39
      2.2.1.1 植物基因组 DNA 的粗提  29-30
      2.2.1.2 植物基因组 DNA 的精提  30
      2.2.1.3 质粒 DNA 的提取  30-31
      2.2.1.4 目的片段的扩增  31-32
      2.2.1.5 DNA 片段与克隆载体的连接  32-33
      2.2.1.6 大肠杆菌 TOP 感受态的制备与转化  33
      2.2.1.7 蓝白斑筛选  33
      2.2.1.8 大肠杆菌的扩大培养  33-34
      2.2.1.9 阳性克隆的鉴定  34
      2.2.1.10 克隆片段的序列测定  34
      2.2.1.11 表达载体的酶切  34-35
      2.2.1.12 DNA 片段的回收  35-36
      2.2.1.13 DNA 片段与表达载体的连接  36
      2.2.1.14 表达载体的构建  36
      2.2.1.15 根瘤农杆菌 GV3101 感受态的制备  36
      2.2.1.16 冻融法根瘤农杆菌 GV3101 感受态的转化  36-37
      2.2.1.17 农杆菌介导的拟南芥遗传转化  37-39
    2.2.2 T-DNA 插入突变体纯合体的筛选  39
      2.2.2.1 T-DNA 插入突变体种子的种植  39
      2.2.2.2 T-DNA 插入突变体纯合植株的筛选  39
    2.2.3 RNA 提取  39-40
      2.2.3.1 材料处理  39-40
      2.2.3.2 RNA 的提取与质量检测  40
      2.2.3.3 RNA 的反转录  40
    2.2.4 实时定量 PCR  40-41
    2.2.5 亚细胞定位  41-42
      2.2.5.1 观察组织的选择与烟草注射  41-42
      2.2.5.2 荧光观察  42
    2.2.6 表型分析  42-43
      2.2.6.1 种子萌发实验  42
      2.2.6.2 幼苗弯根实验  42-43
    2.2.7 拟南芥杂交与杂交株的筛选实验  43-44
3 结果与分析  44-66
  3.1 UGT-LIKE 参与微丝的动态调节并能提高拟南芥对非生物胁迫的耐性  44-50
    3.1.1 UGT-LIKE 基因的表达受 JAS、Lat B、NaCl 和甘露醇的诱导  44-45
    3.1.2 pCAMBIA1300-UGT-LIKE 载体的构建和超表达转基因材料的获得  45-48
    3.1.3 UGT-LIKE 超表达提高了植株进 Lat B 的敏感性  48-50
    3.1.4 过表达 UGT-LIKE 促进微丝的解聚与断裂  50
  3.2 AtUF1 参与拟南芥对盐胁迫的适应机制  50-59
    3.2.1 AtUF1 基因的表达受 Lat B、NaCl、甘露醇和环己酰亚胺的诱导  50-52
    3.2.2 p35S::AtUF1 超表达植株的获得  52-54
    3.2.3 T-DNA 插入突变体纯合体的获得  54-55
    3.2.4 AtUF1 参与了拟南芥对盐胁迫的响应过程  55-57
    3.2.5 AtUF1 超表达提高了植物对 Lat B 的敏感性  57-59
  3.3 AtUF2 参与拟南芥对氧化胁迫的适应机制  59-64
    3.3.1 AtUF2 的表达受盐胁迫和渗透胁迫的诱导  59
    3.3.2 AtUF2 定位于过氧化物酶体  59-62
    3.3.3 AtUF2 参与拟南芥对氧化胁迫的适应机制  62-64
  3.4 其他已选基因的相关研究结果  64-66
4 讨论  66-68
5 结论  68-69
参考文献  69-78
致谢  78-79
攻读学位期间发表论文情况  79

拟南芥中与非生物胁迫相关基因UGT-LIKE、UF1和UF2的初步研究

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