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GCR1，GCR2蛋白在植物感应细菌N-酰基高丝氨酸内酯过程中的作用

作　者: 边子睿
导　师: 宋水山
学　校: 河北工业大学
专　业: 生物化工
关键词: G蛋白偶联受体 N-酰基高丝氨酸内酯 拟南芥 GCR1 GCR2
分类号: Q946
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones, AHLs)是革兰氏阴性细菌群体感应系统中的胞间通讯信号分子,近年来的研究发现,AHLs不仅被细菌自身感知,而且也可以被其寄主植物感知,进而调控真核生物的基因表达和细胞反应。我们根据前人的研究成果大胆推测,植物细胞可能通过异三聚体G蛋白信号转导系统对AHLs进行信号转导,从而激活植物胞内相关基因的表达和一系列反应。胞外信号通过与质膜相结合的G蛋白偶联受体和质膜内侧的G蛋白,将信号转导给效应器并产生胞内第二信使,再由后者调节下游效应器及酶活性。已有的研究证据表明,植物细胞中存在GCR1,GCR2两种G蛋白偶联受体,并参与转导植物激素脱落酸的信号转导过程。本课题对拟南芥野生型Col-0,以及G蛋白偶联受体GCR1,GCR2缺失突变体gcr1-1,gcr2-2植株施加信号分子AHLs。培养基中添加1μmol L-1 3OC6-HSL和10μmol L-1 3OC8-HSL可显著促进野生型拟南芥主根生长,但拟南芥G蛋白偶联受体GCR1和GCR2基因缺失突变体gcr1-1和gcr2-2对AHLs处理不敏感;Real Time PCR分析显示,这两种AHLs的处理可以使拟南芥GCR1和GCR2基因表达量上调2~4倍。结果初步表明,G蛋白偶联受体GCR1和GCR2可能参与植物感应细菌信号进而做出根生长响应的信号转导。构建携带GCR1 , GCR2基因的重组农杆菌EHA(pCAMBIA1301-gcr1) ,EHA(pCAMBIA1301-gcr2),用农杆菌侵染法分别对拟南芥野生型Col-0,突变株gcr1-1,gcr2-2进行转基因。用潮霉素筛选转基因成功的拟南芥种子。将GCR1,GCR2基因分别克隆到表达载体pET-28a,构建重组大肠杆菌BL21(pET-28a-gcr1),BL21(pET-28a-gcr2),用0.5M IPTG诱导,SDS-PAGE和Western Blot检测结果表明,GCR2实现了在大肠杆菌中的表达;分别用0.5M,0.8M,1M和1.5M IPTG诱导,SDS-PAGE和Western Blot检测结果表明,未见GCR1在大肠杆菌中的表达。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
第一章 文献综述  9-13
  §1-1 植物与细菌信号分子的互作  9-10
  §1-2 G 蛋白信号转导系统及其作用  10-11
    1-2-1 异三聚体G 蛋白系统的组成及其信号转导途径  10
    1-2-2 异三聚体G 蛋白在激素信号转导过程中的作用  10-11
  §1-3 G 蛋白偶联受体及其参与的信号转导  11
  §1-4 课题意义  11-13
第二章 GCR1，GCR2 在N-酰基高丝氨酸内酯调节拟南芥根生长过程中的作用  13-23
  §2-1 材料  13-15
    2-1-1 供试菌株及载体  13
    2-1-2 引物  13-14
    2-1-3 主要试剂  14
    2-1-4 仪器设备  14
    2-1-5 培养基及营养液  14-15
  §2-2 方法  15-18
    2-2-1 拟南芥种子的消毒和种植  15
    2-2-2 TRNzol 法提取植物总RNA  15
    2-2-3 RT-PCR  15-16
    2-2-4 拟南芥突变体的鉴定  16
    2-2-5 拟南芥主根长的测定  16-17
    2-2-6 荧光定量PCR  17-18
    2-2-7 Real Time PCR 检测GCR1，GCR2 基因表达量  18
  §2-3 结果  18-20
    2-3-1 拟南芥T-DNA 插入突变体gcr1-1 和gcr2-2 的鉴定  18-19
    2-3-2 AHLs 对不同基因型拟南芥主根生长的影响  19-20
    2-3-3 AHLs 对拟南芥GCR1 和GCR2 基因表达的影响  20
  §2-4 讨论  20-22
  §2-5 小结  22-23
第三章 拟南芥突变体基因回复植株和过表达植株的构建  23-34
  §3-1 材料  23-26
    3-1-1 供试植株菌株及载体  23
    3-1-2 引物  23-24
    3-1-3 主要试剂  24
    3-1-4 仪器设备  24
    3-1-5 培养基  24-25
    3-1-6 溶液配制  25-26
  §3-2 方法  26-30
    3-2-1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备  26
    3-2-2 大肠杆菌DH5α的热激转化  26-27
    3-2-3 从菌液中提取质粒DNA  27
    3-2-4 从琼脂糖凝胶中回收DNA 片段  27-28
    3-2-5 制备农杆菌EHA105 感受态  28
    3-2-6 农杆菌EHA105 的热激转化  28
    3-2-7 农杆菌EHA105 表达载体pCAMBIA1301-gcr1, pCAMBIA1301-gcr2 的构建  28-29
    3-2-8 农杆菌EHA105 介导拟南芥转基因  29-30
    3-2-9 转基因拟南芥的筛选  30
  §3-3 结果  30-32
    3-3-1 GCR1，GCR2 基因真核表达载体pCAMBIA1301-gcr1，pCAMBIA1301-gcr2 的构建  30-32
    3-3-2 转基因拟南芥的筛选  32
  §3-4 小结  32-34
第四章 GCR1，GCR2 蛋白在大肠杆菌中的表达和鉴定  34-46
  §4-1 材料  34-38
    4-1-1 供试菌株及载体  34
    4-1-2 引物  34
    4-1-3 主要试剂  34-35
    4-1-4 仪器设备  35
    4-1-5 培养基  35
    4-1-6 溶液配制  35-38
  §4-2 方法  38-42
    4-2-1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备  38
    4-2-2 大肠杆菌DH5α的热激转化  38
    4-2-3 从菌液中提取质粒DNA  38
    4-2-4 从琼脂糖凝胶中回收DNA  38
    4-2-5 制备大肠杆菌BL21 感受态  38-39
    4-2-6 大肠杆菌BL21 的热激转化  39
    4-2-7 重组表达质粒的构建  39-40
    4-2-8 重组大肠杆菌BL21(pET-28a-gcr1)，大肠杆菌BL21(pET-28a-gcr2)的诱导表达  40
    4-2-9 SDS-PAGE 分析  40-41
    4-2-10 Western Blot 检测  41-42
  §4-3 结果  42-45
    4-3-1 GCR1，GCR2 原核表达载体pET28a-gcr1 和pET28a-gcr2 的构建  42-43
    4-3-2 表达产物GCR1，GCR2 蛋白的SDS-PAGE 和Western Blot 分析  43-45
  §4-4 小结  45-46
第五章 结论  46-47
第六章 展望  47-48
参考文献  48-52
致谢  52-53
攻读学位期间所取得的相关科研成果  53

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物生物化学
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