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大肠杆菌K88、K99广谱噬菌体的分离与生物学特性鉴定

作　者: 何觅之
导　师: 龙良启
学　校: 华中农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 大肠杆菌K88、K99 噬菌体生物学特性
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

自从大肠杆菌第一次被人们发现以来,致病大肠杆菌在全球范围内给养殖业造成了严重的损失。在大肠杆菌众多的血清型中,尤以E.coli K88、E.coli K99最为广泛,到目前为止尚无有效的措施和药物预防和控制。噬菌体作为一种细菌病毒,能对宿主菌进行特异裂解,这一特性使得研究者找到了治疗细菌性问题的新思路和新方法。近来相关研究表明：治疗性噬菌体制剂拥有使用剂量小、疗效好、无毒副作用、疗效快等抗生素无法比拟的优点。美国FDA在2007年批准上市的大肠杆菌0157：H7噬菌体制剂,标志着噬菌体制剂研究的进入了临床研究的新阶段。本试验采用双层琼脂平板法来进行噬菌体的分离和纯化,并且以E.coli K88为宿主菌,分离到1株烈性噬菌体,将其命名为Bp8A0811；以E.coli K99为宿主菌分离得到2株烈性噬菌体,分别将其命名为Bp9B1226、Bp9C1213。其中2株E.coli K99噬菌体的效价较高,可以达到1010pfu/ml,Bp8A0811的效价与Bp9B1226、Bp9C1213的效价为109pfu/ml。刚开始分离得到的噬菌斑较小,经进一步的纯化后,其噬菌斑明显增大,对宿主菌的裂解能力增强。通过3株噬菌体对E.coli K88、E.coli K99及鸡大肠杆菌的裂解谱和裂解曲线的测定,发现Bp8A0811基本不能裂解E.coli K99、鸡大肠杆菌,其对这两种细菌的裂解曲线与对照组曲线相差不大。Bp9B1226、Bp9C1213对E.coli K99的裂解曲线除了在刚开始的时候有一点上升,很快就会下降；Bp9B1226、Bp9C1213对E.coli K88的裂解曲线在上升段的时间比E.coli K99上升段的时间长,其裂解E.coli K88的能力较Bp8A0811弱。3株噬菌体都不能裂解鸡大肠杆菌,且噬菌体与细菌的混合液的OD600值一直呈上升的趋势。通过对Bp9B1226噬菌体生物学特性研究发现,其热稳定性较好,在60℃水浴作用30min仍有较高的效价；但其对温度耐受性不高,当水浴时间延长至60min后,其效价下降较多。Bp9B1226噬菌体在pH6-9范围内效价较稳定,在pH小于5和pH大于10时,其效价明显下降。本实验研究探讨了4种不同的保存方法,发现噬菌体在4℃和-80℃保存的效果较好,其效价在6个月内仅下降2-3个数量级,这两种保存方法适合用于6个月内的保存；常温和-20℃都不能长期保存,超过3个月的保存时间,效价受到较大的影响。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-8
1 文献综述  8-16
  1.1 噬菌体研究概述  8-11
    1.1.1 噬菌体研究进展  8-9
    1.1.2 噬菌体制剂研究进展  9-10
    1.1.3 噬菌体疗法的优势  10
    1.1.4 噬菌体制剂研制面临的问题  10-11
    1.1.5 噬菌体制剂研制的解决办法  11
  1.2. 大肠杆菌K88、K99研究概述  11-15
    1.2.1 大肠杆菌病原学研究概述  11-13
    1.2.2 产肠毒素大肠杆菌病流行病学研究概述  13-14
    1.2.3 猪大肠杆菌的耐药性问题  14-15
  1.3 本实验的目的与意义  15-16
2 试验材料与方法  16-24
  2.1 试验仪器及材料  16-18
    2.1.1 菌种及样品  16
    2.1.2 试剂  16
    2.1.3 仪器  16-17
    2.1.4 试剂的配制  17-18
  2.2 试验方法  18-24
    2.2.1 菌种复苏和细菌悬液的制备  18
    2.2.2 活菌培养计数  18-19
    2.2.3 噬菌体的分离  19
    2.2.4 噬菌斑的纯化  19-20
    2.2.5 原种噬菌体的大量增殖  20-21
    2.2.6 噬菌体效价的测定  21
    2.2.7 噬菌体裂解谱和裂解曲线的测定  21
    2.2.8 噬菌体对不同细菌感染敏感性的测定  21-22
    2.2.9 最佳感染复数的测定  22
    2.2.10 噬菌体一步生长曲线的测定  22
    2.2.11 噬菌体的热稳定性  22
    2.2.12 噬菌体的pH稳定性  22-23
    2.2.13 噬菌体的保存  23-24
3 结果及分析  24-34
  3.1 噬菌体的分离  24
  3.2 噬菌斑的纯化  24-27
  3.3 噬菌体的效价  27
  3.4 噬菌体裂解谱的测定结果  27-28
  3.5 噬菌体对细菌的裂解曲线  28-30
  3.6 噬菌体对细菌感染敏感性的测定结果  30
  3.7 最佳感染复数的测定  30-31
  3.8 噬菌体一步生长曲线的绘制  31
  3.9 噬菌体的热稳定性  31-32
  3.10 噬菌体的pH稳定性  32-33
  3.11 噬菌体的保存  33-34
4 讨论  34-37
  4.1 噬菌体的效价的测定  34
  4.2 噬菌体的pH和热稳定性测定  34
  4.3 噬菌体的裂解谱及对细菌感染敏感性的测定  34-35
  4.4 噬菌体的裂解曲线的测定  35
  4.5 噬菌体的最佳感染复数和一步生长曲线的测定  35-36
  4.6 噬菌体的保存  36-37
5 结论  37-38
参考文献  38-43
致谢  43

大肠杆菌K88、K99广谱噬菌体的分离与生物学特性鉴定

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