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两亲分子对CBH1结构和功能的影响

作　者: 戚明
导　师: 张为灿
学　校: 山东大学
专　业: 生物工程
关键词: 纤维素酶表面活性剂圆二色光谱荧光光谱
分类号: Q55
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

纤维素在自然界中含量丰富,其降解是生物质资源利用的关键。为了提高纤维素降解效率,阐明纤维素酶的结构和功能的关系有着重大意义。在生物化学上,表面活性剂的特殊结构有优良的增溶作用。作为两亲分子,表面活性剂拥有极性头和疏水尾；而在不同pH溶液中,蛋白质能表现出两性电解质的特性,二者之间相互作用。瑞氏木霉是可利用纤维素真菌的模式生物,其CBH1产量达到胞外分泌纤维素酶的60%,CBH1具有优良的应用潜力。经过DEAE-sepharose FF阴离子交换柱层析,得到了CBH1纯酶,经过SDS-PAGE电泳检测,显示出单一条带。选择20mmol/L的pH5.0的醋酸盐缓冲液和20mmol/L的磷酸盐缓冲液。实验中CBH1浓度为0.5mg/ml,30℃下,将三种表面活性剂配成不同的浓度梯度。然后用各浓度预处理CBH1两小时(选定的时间),扫描圆二色光谱和内源荧光光谱；紫外-可见电子吸收光谱,扫描从各个梯度浓度的表面活性剂加入后两个小时内的谱图。实验结果表明,CBH1的功能,即CMC、pNPC的降解能力,在被三种表面活性剂：SDS、SOS、CTAB处理之后,与其结构变化之间有强烈的对应关系。强变性的阴离子表面活性剂SDS,与带净正电荷CBH1(处于pH3.0缓冲液中)有强烈的静电作用,内源荧光强度减弱,二级结构变化,纤维素酶活性受到干扰,在pH5.0的缓冲体系中透析除去SDS后,酶活性有所恢复,而在pH3.0的缓冲体系中透析除去SDS后,酶活性几乎没有恢复。当CBH1带净负电荷(pH5.0)时,没有静电吸引力,酶活力因SDS疏水作用而下降不大。带短烃链的阴离子表面活性剂SOS与CBH1相互作用的结果显示,SOS疏水作用较弱,对CBH1的酶活影响较小,在pH3.0的缓冲体系中,静电作用是主要的相互作用,在SOS浓度很高时,CBH1的活性有所降低。而在pH5.0的缓冲体系中,SOS完全不破环CBH1的活性。透析除去SOS的结果与SDS类似。阳离子表面活性剂CTAB和CBH1的作用结果：在pH3.0时CBH1带净静正电荷,CTAB的加入对酶活性没有影响。在pH5.0时,CBH1带静负电荷,CTAB使得CBH1表观酶活力降低但不是完全失去。在pH5.0和pH3.0的缓冲液中,透析除去CTAB,酶活几乎可以完全恢复。等温低定量热实验给出的结果,验证了表面活性剂与CBH1的相互作用是静电作用为主导的。综合来看,静电作用在表面活性剂影响蛋白质的结构与功能的过程中是主要影响因素,而疏水作用是次要影响因素。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
缩写词表  12-13
第一章绪论  13-31
  1.1 蛋白质结构与功能的研究进展  13-16
  1.3 两亲分子的引入  16-17
  1.4 蛋白质与两亲分子相互作用  17-19
  1.5 蛋白质与表面活性剂相互作用的研究方法  19-21
    1.5.1 紫外吸收光谱  19
    1.5.2 内源荧光光谱  19-20
    1.5.3 圆二色谱法  20
    1.5.4 微量量热技术  20-21
  1.6 世界能源危机  21-30
    1.6.1 纤维素酶的分类  22-23
    1.6.2 纤维素酶的功能  23
    1.6.3 纤维素酶的降解机制  23-24
    1.6.4 纤维素酶的结构  24-25
    1.6.5 模式微生物T.reesei的纤维素酶系  25
    1.6.6 CBH1的分子结构  25-30
  1.7 本论文研究目的及意义  30-31
第二章里氏木霉纤维素酶CBH Ⅰ的分离纯化  31-35
  2.1 实验材料  31
    2.1.1 主要仪器与试剂  31
  2.2 实验方法  31-32
    2.2.1 CBH1的活力测定  31-32
    2.2.2 CBH1的分离纯化方案  32
  2.3 结果分析  32-34
    2.3.1 CBH Ⅰ的分离图谱  32-34
    2.3.2 SDS-PAGE电泳检测纯度  34
  2.4 本章小结  34-35
第三章 SDS对CBH Ⅰ结构和功能的影响  35-55
  3.1 SDS性质简介  35
  3.2 实验材料  35-36
    3.2.1 主要实验仪器与试剂  35-36
  3.3 实验方法  36-38
    3.3.1 CBH1的活力测定  36
    3.3.2 蛋白含量测定  36-37
    3.3.3 SDS处理  37
    3.3.4 紫外吸收光谱的测定  37
    3.3.5 内源荧光的测定  37
    3.3.6 圆二色光谱的测定  37
    3.3.7 透析方法  37
    3.3.8 等温滴定量热  37-38
  3.4 实验结果与讨论  38-53
    3.4.1 不同pH体系SDS浓度对CBH1活性的影晌  38-40
    3.4.2 不同浓度SDS处理CBH1的紫外—可见光谱结果  40-41
    3.4.3 不同浓度SDS处理CBH1的内源荧光光谱结果  41-45
    3.4.4 不同浓度SDS对CBH1的圆二色光谱的影响  45-49
    3.4.5 等温滴定量热  49-53
  3.5 本章总结  53-55
第四章 SOS对CBH Ⅰ结构和功能的影响  55-74
  4.1 SOS性质简介  55
  4.2 实验材料  55
    4.2.1 主要实验仪器与试剂  55
  4.3 实验方法  55-58
    4.3.1 CBH1的活力测定  55-56
    4.3.2 蛋白含量测定  56
    4.3.3 SOS处理  56
    4.3.4 紫外吸收光谱的测定  56-57
    4.3.5 内源荧光的测定  57
    4.3.6 圆二色光谱的测定  57
    4.3.7 透析方法  57
    4.3.8 等温滴定量热  57-58
  4.4 实验结果与分析  58-72
    4.4.1 pH5.0体系不同浓度SOS对CBH Ⅰ的活性影响  58-59
    4.4.2 不同浓度SOS对CBH1紫外可见光谱的影响  59-61
    4.4.3 不同浓度SOS对CBH1的内源荧光的影响  61-65
    4.4.4 不同浓度SOS对CBH1的圆二色光谱的影响  65-68
    4.4.5 等温滴定量热  68-72
  4.5 本章小结  72-74
第五章 CTAB对CBH Ⅰ结构和功能的影响  74-87
  5.1 CTAB性质简介  74
  5.2 实验材料  74-75
    5.2.1 主要实验仪器与试剂  74-75
  5.3 实验方法  75-77
    5.3.1 CBH1的活力测定  75
    5.3.2 蛋白含量测定  75-76
    5.3.3 CTAB处理  76
    5.3.4 紫外吸收光谱的测定  76
    5.3.5 内源荧光的测定  76
    5.3.6 圆二色光谱的测定  76
    5.3.7 透析方法  76
    5.3.8 等温滴定量热  76-77
  5.4 实验结果与分析  77-85
    5.4.1 不同浓度CTAB对CBH Ⅰ的纤维素酶活性的影响  77-79
    5.4.2 不同浓度CTAB对CBH1的紫外可见光谱的影响  79-80
    5.4.3 不同浓度CTAB对CBH1的内源荧光的影响  80-82
    5.4.4 等温滴定量热  82-85
  5.5 本章总结  85-87
全文总结  87-89
参考文献  89-94
致谢  94-95
学位论文评阅及答辩情况表  95

两亲分子对CBH1结构和功能的影响

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