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Sorting Nexin7调节斑马鱼肝脏发育的机制研究

作　者: 徐良亮
导　师: 裴端卿
学　校: 清华大学
专　业: 生物学
关键词: 分选蛋白7 发育肝脏凋亡 c‐FLIPs
分类号: Q51
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

肝脏是脊椎动物体内最大的内脏器官，同时也是与代谢相关的最重要的器官，而与肝脏相关的各种疾病一直以来都是对人类健康最重大的威胁之一。阐明肝脏的发育过程及其行使生理功能的分子机制，一直都是生物医学研究的重要领域。分选蛋白（Sorting Nexin，SNX）是一类有着共同的PX（Phox）结构域的基因家族，它们多分布在细胞内膜系统的各个位置，广泛参与细胞内蛋白质的运输和分选过程并起着重要的调节作用。在人类的基因组中，迄今已鉴定并命名了33个SNX家族成员，但目前的研究报道仅仅涉及到其中的一小部分。本论文所论述的研究是第一次用斑马鱼动物模型从胚胎整体和器官发育水平对SNX潜在的生理功能进行的研究，我们发现SNX7是一个在肝脏特异表达的SNX家族成员，它的异常表达能够特异性地抑制斑马鱼胚胎肝脏的发育而对其他内脏器官和整体胚胎的发育则没有明显的影响，进一步的研究发现，由morpholino介导的SNX表达的敲降并不影响早期内胚层前体细胞向肝祖细胞的转化，但接下来肝祖细胞进一步的生长增殖和成熟过程则受到了显著的抑制,在分子水平，我们发现一些与凋亡过程相关的关键因子，如Caspase8，bax，p53及其相关的靶标基因的表达水平在SNX7敲降的斑马鱼胚胎中都有着显著地升高，为此我们得出结论：在斑马鱼胚胎早期肝脏发育过程中，SNX7通过某条抑制凋亡的信号通路对肝祖细胞的存活起着不可替代地调控作用。紧接着，在体外试验中，用siRNA转染特异性敲降SNX7表达的方法在HeLa细胞系中能够有效地诱导出凋亡，并最终找到了SNX7在诱导凋亡过程中重要的下游靶分子：c‐FLIPs，体内挽救实验确凿无疑地证明了c‐FLIPs就是联系SNX7和凋亡的关键分子。在本论文阐述的研究中，我们结合体内外的多种技术手段，分析了SNX7对于包括肝脏在内的内胚层各器官发育的影响，重点研究了SNX7调节肝祖细胞生长/分化/凋亡的机制，并对SNX7调节肝脏发育所涉及的上、下游信号通路进行了初步探究，试图在将来从分子、细胞以及器官和胚胎整体水平阐明SNX7的作用机制，从而建立一个包括SNX7在内的调节肝脏发育的信号通路网络。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
第1章引言  9-39
  1.1 SNX（Sorting Nexin）蛋白家族  10-17
    1.1.1 SNX 的定义、基本结构和分类  10-12
    1.1.2 BAR 结构域  12-14
    1.1.3 有关 SNX 蛋白家族生理功能的研究现状  14-17
  1.2 斑马鱼肝脏发育过程  17-24
    1.2.1 斑马鱼是研究肝脏发育的理想模型  17-18
    1.2.2 肝祖细胞的起源和特化  18
    1.2.3 肝脏原基的形成和生长  18-20
    1.2.4 肝脏发育在细胞和分子水平的调控  20-24
  1.3 凋亡  24-28
  1.4 泛素和蛋白酶体系统  28-36
    1.4.1 泛素和蛋白酶体系统基本概念  28-30
    1.4.2 E2 和 E3 泛素酶  30-33
    1.4.3 蛋白酶体  33-36
  1.5 课题问题的提出、实验方案设计  36-38
    1.5.1 课题问题的提出及其意义  36-37
    1.5.2 实验方案的设计  37-38
  1.6 本论文的结构安排  38-39
第2章材料与方法  39-61
  2.1 实验材料  39-43
    2.1.1 斑马鱼品系  39
    2.1.2 主要仪器和试剂  39-43
  2.2 实验方法  43-61
    2.2.1 生物信息学方法分析斑马鱼 SNX 序列信息  43
    2.2.2 分子克隆  43
    2.2.3 斑马鱼的饲养和胚胎收集  43-44
    2.2.4 体外转录合成地高辛标记 RNA 探针  44-45
    2.2.5 morpholino 特异性敲降目标基因和挽救（Rescue）  45
    2.2.6 体外转录合成 mRNA  45-47
    2.2.7 斑马鱼胚胎总 RNA 的提取，反转录和 PCR 扩增 SNX7  47-48
    2.2.8 TUNEL 法检测整体胚胎凋亡信号  48
    2.2.9 磷酸化组蛋白 3（pH3）抗体胚胎整体免疫荧光染色  48-49
    2.2.10 斑马鱼胚胎整体原位杂交  49-51
    2.2.11 荧光实时定量 PCR  51-53
    2.2.12 细胞培养，转染和流式细胞分析  53-54
    2.2.13 Western blot 免疫印迹  54-58
    2.2.14 HeLa 细胞免疫荧光染色  58-61
第3章结果  61-88
  3.1 生物信息学方法对人和斑马鱼 SNX 基因家族进行谱系分析  61-63
  3.2 原位杂交（In‐situ hybridization）结果显示 SNX 家族的多个基因在肝脏和消化道中有特异性的表达  63-65
  3.3 通过注射 morpholino 敲降 SNX7 表达的斑马鱼胚胎表现出肝脏发育的异常和停滞，通过挽救实验可逆转其缺陷表型  65-69
  3.4 SNX7 特异地作用于肝祖细胞特化形成肝细胞的阶段  69-71
  3.5 磷酸化组蛋白 H3（pH3）染色结果表明，SNX7 对细胞增殖并无明显抑制作用  71-74
  3.6 斑马鱼胚胎整体凋亡信号染色（TUNEL）表明 SNX7 能够在特定阶段特异性地诱导肝脏细胞的凋亡  74-77
  3.7 SNX7 的敲降引起与凋亡相关基因表达水平的改变  77-79
  3.8 体外 HeLa 细胞系凋亡模型的建立  79-81
  3.9 c‐FLIPS 是 SNX7 凋亡分子机制中的关键分子  81-88
第4章讨论  88-98
  4.1 为何要选用斑马鱼作为研究肝脏发育的模型  88-89
  4.2 SNX7 是首次被报道的参与动物器官发生的 SNX 家族成员  89-90
  4.3 SNX7 调节肝脏发育的途径不同于已有基因  90-91
  4.4 SNX7 作用于肝脏发育的某一特定阶段  91-92
  4.5 SNX7 和肝脏发育信号通路  92-93
  4.6 SNX7 调控凋亡过程的可能机制  93-95
  4.7 SNX7 功能在进化上的保守性及其与肿瘤发生的联系  95-98
参考文献  98-105
致谢  105-107
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  107

Sorting Nexin7调节斑马鱼肝脏发育的机制研究

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