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CHIP负调控Smad1/5蛋白的分子机理

作　者: 王乐
导　师: 吴嘉炜
学　校: 清华大学
专　业: 生物学
关键词: CHIP Smad 泛素化 热休克蛋白
分类号: Q51
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


转化生长因子-β (TGF-β)超家族信号通路广泛存在于果蝇、线虫和哺乳动物中，调控细胞的生长、分化、凋亡和生物体发育等活动，其功能紊乱与多种人类癌症紧密相关。Smad家族蛋白是细胞内负责传导TGF-超家族信号的关键元件。TGF-β超家族配体通过Smad2/3介导的TGF-β/激活素通路和Smad1/5/8介导的骨形态发生蛋白(BMP)通路传导信号。Hsc70碳末端相互作用蛋白(CHIP)作为一种泛素E3连接酶介导Smad蛋白和许多其它信号蛋白的降解。然而，CHIP蛋白负调控TGF-β信号的分子机制仍然不清楚。本论文综合运用结构生物学和蛋白与细胞水平的生物化学手段研究CHIP识别并调控Smad家族成员的分子机理。在成功表达纯化得到多种形式的重组CHIP和Smad蛋白的基础上，我们的研究工作表明Smad1的碳末端序列对于其直接与CHIP蛋白的TPR结构域结合是必不可少的。有趣的是，CHIP能够在分子伴侣不存在的情况下介导Smad1泛素化，而且Smad1碳末端“SXS”基序的磷酸化会增强该相互作用和泛素化效率。我们也发现CHIP倾向于结合Smad1/5，并特异性地破坏由Smad1/5与Smad4形成的信号传导核心复合物。我们解析了CHIP-TPR分别与磷酸化/拟磷酸化Smad1多肽和Hsp70/Hsc70碳末端多肽复合物的晶体结构。结构分析和后续的生物化学研究表明Smad1/5与Smad2/3对于结合CHIP亲和力的显著差异源于R-Smad碳末端不保守的疏水残基。出乎我们预料的是，Smad1与Hsp70、Hsc70和Hsp90等分子伴侣的碳末端多肽结合于CHIP-TPR表面的同一凹槽中，这些热休克蛋白与Smad1/5竞争性地结合CHIP，并相应地抑制而不是促进，CHIP介导的Smad1/5泛素化。综上所述，我们得出结论认为CHIP从具有生物学功能的R-/Co-Smad复合物中招募Smad1/5，并进一步促进其通过非依赖于分子伴侣的方式泛素化/降解，进而抑制Smad1/5的信号转导活力。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-15
第1章 引言  15-40
  1.1 TGF- 超家族信号通路概述  15-18
    1.1.1 信号传导方式  15-16
    1.1.2 TGF- 超家族通路配体  16
    1.1.3 TGF- 超家族通路受体  16-18
  1.2 Smad 家族蛋白  18-24
    1.2.1 Smad 家族蛋白的发现和结构域划分  18-20
    1.2.2 Smad 家族蛋白的结构  20-24
  1.3 TGF- 超家族信号通路在 Smad 蛋白层次上的调控  24-33
    1.3.1 I-Smad 负调控 TGF- 超家族信号通路  25-26
    1.3.2 泛素-蛋白酶体通路负调控 TGF- 超家族信号通路  26-30
      1.3.2.1 泛素化系统简介  26-28
      1.3.2.2 HECT 家族泛素 E3 连接酶泛素化降解 Smad 蛋白  28-29
      1.3.2.3 其它泛素 E3 连接酶泛素化降解 Smad 蛋白  29-30
    1.3.3 蛋白磷酸酶调控 TGF- 超家族信号通路  30-32
    1.3.4 R-Smad/Co-Smad 复合物的解离  32-33
    1.3.5 蛋白-蛋白相互作用调控 TGF- 超家族信号通路  33
  1.4 CHIP 蛋白  33-38
    1.4.1 CHIP 蛋白简介  33-36
    1.4.2 CHIP 蛋白的结构  36
    1.4.3 CHIP 蛋白的功能  36-37
    1.4.4 CHIP 负调控 TGF- 信号通路  37-38
  1.5 本研究的意义与技术路线  38-40
第2章 SMAD 和 CHIP 蛋白的制备  40-62
  2.1 引言  40
  2.2 材料与方法  40-49
    2.2.1 cDNA  40
    2.2.2 载体  40
    2.2.3 菌种  40-41
    2.2.4 试剂  41
    2.2.5 蛋白纯化柱和柱材  41-42
    2.2.6 仪器  42
    2.2.7 大肠杆菌表达质粒的构建与筛选  42-46
      2.2.7.1 DNA 引物的设计  42
      2.2.7.2 PCR  42-43
      2.2.7.3 DNA 片段的回收  43
      2.2.7.4 DNA 限制性内切酶酶切  43-44
      2.2.7.5 目的 DNA 片段与表达载体连接  44
      2.2.7.6 JM109 (DE3) 超级感受态细胞的制备  44-45
      2.2.7.7 连接产物转化 JM109 (DE3) 超级感受态细胞  45
      2.2.7.8 阳性克隆的筛选  45
      2.2.7.9 突变体的构建  45-46
    2.2.8 蛋白的表达与纯化方法  46-49
      2.2.8.1 BL21（DE3）感受态细胞的制备  46-47
      2.2.8.2 目的蛋白的表达  47
      2.2.8.3 重组表达蛋白的提取  47
      2.2.8.4 利用镍亲和层析柱纯化蛋白  47-48
      2.2.8.5 利用 GST 亲和层析柱纯化蛋白  48
      2.2.8.6 亲和柱上酶切去除亲和标签  48
      2.2.8.7 利用离子交换层析柱纯化蛋白  48
      2.2.8.8 浓缩蛋白  48-49
      2.2.8.9 利用分子筛层析柱纯化蛋白  49
  2.3 结果与讨论  49-61
    2.3.1 Smad 家族蛋白的表达与纯化  49-58
      2.3.1.1 Smad 家族全长蛋白的表达与纯化  49-51
      2.3.1.2 Smad1/2/3/4/5-MH1 的表达与纯化  51-52
      2.3.1.3 Smad1/5-MH2 的表达与纯化  52-53
      2.3.1.4 Smad2-MH2 的表达与纯化  53-55
      2.3.1.5 Smad1/2/4/5-L-MH2 的表达与纯化  55-56
      2.3.1.6 Smad3-L-MH2 的表达与纯化  56
      2.3.1.7 Smad6/7/8 的表达与纯化  56-58
    2.3.2 CHIP 蛋白的表达与纯化  58-61
  2.4 小结  61-62
第3章 CHIP 结合 SMAD1 碳末端尾巴  62-76
  3.1 引言  62
  3.2 材料与方法  62-67
    3.2.1 cDNA 和表达质粒  62
    3.2.2 蛋白浓度的测定  62
    3.2.3 分子筛层析方法研究蛋白-蛋白相互作用  62-64
    3.2.4 GST pulldown 方法研究蛋白-蛋白相互作用  64
    3.2.5 真核表达质粒的构建与筛选  64
    3.2.6 HEK293T 细胞的培养与传代  64-65
    3.2.7 免疫共沉淀方法研究蛋白-蛋白相互作用  65
    3.2.8 蛋白质印迹 (免疫印迹)  65-66
    3.2.9 体外泛素化  66-67
  3.3 结果与讨论  67-75
    3.3.1 CHIP-TPR 负责结合 Smad1  67-69
    3.3.2 Smad1-MH2 负责结合 CHIP  69-70
    3.3.3 Smad1 碳末端缺失突变体不结合 CHIP  70-73
    3.3.4 CHIP 倾向于结合激活状态 Smad1  73-74
    3.3.5 CHIP 倾向于泛素化激活状态 Smad1  74-75
  3.4 小结  75-76
第4章 CHIP-SMAD1 复合物晶体结构的解析  76-91
  4.1 引言  76
  4.2 材料与方法  76-81
    4.2.1 Smad1 多肽  76
    4.2.2 结晶条件筛选试剂盒  76
    4.2.3 试剂  76
    4.2.4 仪器  76-77
    4.2.5 结晶样品制备  77
    4.2.6 晶体初步筛选  77-78
    4.2.7 晶体优化  78-81
    4.2.8 选择防冻液  81
  4.3 结果与讨论  81-90
    4.3.1 晶体的筛选与优化  81-84
    4.3.2 数据收集  84
    4.3.3 结构解析  84
    4.3.4 结构分析  84-90
  4.4 小结  90-91
第5章 分子伴侣抑制 CHIP 泛素化 SMAD177  91-101
  5.1 引言  91
  5.2 材料与方法  91-93
    5.2.1 质粒  91
    5.2.2 分子伴侣多肽  91
    5.2.3 仪器  91
    5.2.4 等温滴定量热方法研究蛋白-蛋白相互作用  91-93
  5.3 结果与讨论  93-100
    5.3.1 Hsp70/Hsc70-C 多肽与 CHIP-TPR 复合物晶体结构  93-95
    5.3.2 分子伴侣与 Smad1 竞争性结合 CHIP  95-99
    5.3.3 分子伴侣抑制 CHIP 泛素化 Smad1  99-100
  5.4 小结  100-101
第6章 CHIP 特异性识别 SMAD1/587  101-107
  6.1 引言  101
  6.2 结果与讨论  101-106
    6.2.1 CHIP 结合 Smad5，不结合 Smad2、Smad3 和 Smad4  101-103
    6.2.2 疏水氨基酸残基提供识别特异性  103-105
    6.2.3 CHIP 破坏具有生物学活力的 R-/Co-Smad 复合体  105-106
  6.3 小结  106-107
第7章 其它相关研究工作  107-118
  7.1 CHIP 蛋白其它片段结构生物学研究  107-110
  7.2 Smad 蛋白相关蛋白磷酸酶研究  110-116
    7.2.1 Smad 蛋白磷酸酶之 SCP  110-113
    7.2.2 Smad 蛋白磷酸酶之 PPM1A  113-114
    7.2.3 Smad 蛋白磷酸酶之 PDP  114-116
  7.3 小结  116-118
第8章 总结与展望  118-122
  8.1 总结  118-120
  8.2 展望  120-122
参考文献  122-131
致谢  131-133
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  133

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质
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