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活性氧调节mTOR信号及其分子机制

作　者: 李明
导　师: 罗深秋; 白晓春
学　校: 南方医科大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 活性氧 mTOR 信号转导
分类号: Q504
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian Target Of Rapamycin,mTOR）是一种丝/苏氨酸蛋白质激酶,大环内酯类药物rapamycin可特异性抑制mTOR。作为细胞内多种生理活动的中心调控分子,mTOR可接受并整合细胞内外的各种刺激如激素、生长因子、营养、能量、缺氧、应激等调节蛋白质翻译、细胞生长增殖、存活、自噬、迁移、血管形成等生理过程。人类一系列重大疾病如癌症、心血管疾病、移植排斥及自体免疫紊乱、糖尿病、肥胖、神经系统疾病等均涉及mTOR信号的失调,mTOR信号通路成为近年生命科学领域的研究热点。mTOR在细胞内通过与其它分子形成复合物而保持生物学活性,目前认为主要有两种复合物:mTORC1（mTOR complex1）和mTORC2。mTORC1由mTOR、Raptor（regulatory-associated protein of mTOR）和mLST8/GβL（G proteinβunit-like protein）组成。生长因子、胰岛素等可通过与受体结合并活化肌醇三磷酸激酶（PI-3K）,后者通过PI-3K依赖的激酶1（PDK1）激活蛋白激酶B（PKB/Akt）。激活的Akt可磷酸化结节性硬化复合物2（tuberoussclerosis complex 2,TSC2）并减弱后者对小G蛋白Rheb的抑制作用。活化的Rheb则激活mTORC1。此外,缺少能量（AMP/ATP比例增加）时,AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）可通过激活TSC2或磷酸化Raptor（S792）抑制mTORC1。mTORC1下游的直接底物为S6K1和4E-BP1（eIF4E binding protein 1）。前者被mTOR磷酸化（T389）激活后可通过磷酸化核糖体蛋白S6促进核糖体的发生,后者磷酸化后活性被抑制,不能再结合并抑制真核细胞翻译起始因子eIF4E从而促进cap依赖的翻译,两者共同促进蛋白质合成。S6K1的T389、S6的S235/236及4E-BP1的T37/46位点的磷酸化通常作为mTORC1活性检测标志。mTORC2包括mTOR、mLST8/GβL及Rictor（rapamycin-insensitive companionof mTOR）和Sin1（SAPK interacting protein 1）,其被活化的机制还不清楚,mTORC2的主要功能为磷酸化蛋白激酶B（PKB/Akt）的473位丝氨酸以及通过蛋白激酶C-α（PKC-α）调节细胞骨架重组。机体处于氧化应激状态时,细胞内过多的活性氧（ROS）可作为第二信使介导多种信号通路。这些信号通路交互反应的结果使得细胞最后或者生长、增殖或者凋亡甚至死亡。氧化应激与衰老及人类许多重大疾病如肿瘤发生、心力衰竭、心肌肥大、动脉粥样硬化、糖尿病、高血压、神经退行性疾病、帕金森氏病、骨质疏松等的发生和发展关系密切。因此,氧化应激所介导的信号通路研究也是人们近年来关注的热点。近年来研究发现ROS参与了mTOR信号通路。但是已有的研究中既有ROS激活mTORC1的报道,又有认为ROS抑制mTORC1,结论不一。无论激活还是抑制,具体机制还不清楚。ROS对mTORC2的调控未见报道。因此本课题利用UV,H2O2诱导细胞内活性氧和四氧嘧啶诱导小鼠体内活性氧,从整体、细胞和分子水平ROS对mTORC1与mTORC2信号的调控及其分子机制。一、ROS调控mTORC1的方式（一）体内与体外研究发现ROS可激活mTORC1细胞内的研究发现,在一些细胞中,如小鼠成骨细胞MC3T3-E1、小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和人乳腺癌细胞MCF-7,低浓度H2O2（0-200μM）可以激活mTORC1下游分子S6K1（T389）,但不同细胞被H2O2激活时所需的最低浓度、最短作用时间及持续时间不同（MC3T3-E1细胞中S6K1在9 h后活性被抑制）。在另一些细胞中,如人胚肾细胞HEK293、人骨肉瘤细胞MG63及原代培养的小鼠骨髓基质细胞（BMSC）和成骨细胞,各种浓度H2O2均不能激活mTORC1。此外,我们以UV照射细胞,引起细胞内ROS明显增加,并激活S6K1（T389）。在四氧嘧啶诱导的小鼠氧化应激模型中,小鼠脑、心、肝、肾和骨骼肌组织内的H2O2和脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量明显升高,同时伴随脑、心、肾、骨骼肌的S6K1（T389）磷酸化水平明显升高,心肌和骨骼肌的S6（S235/236）磷酸化水平也有显著增高。以上表明,ROS可呈现时间、浓度和细胞依赖地激活mTORC1。（二）高浓度ROS抑制mTORC1在所检测的的各种细胞中,高浓度H2O2（0.5-5 mM）均可抑制mTORC1,呈现时间依赖性、浓度依赖性和细胞依赖性。细胞依赖性解释为:当H2O2抑制HEK293、MC3T3-E1、MG63、MEF等细胞的mTORC1活性（PS6K1（T389）、PS6（S235/236）、P4E-BP1（T37/46、S65和T70））时,不同细胞mTORC1被H2O2抑制时所需的最低浓度和最短时间作用不同。ROS调节mTORC1的时间、浓度、细胞依赖性可以很好地解释为何先前的研究即有H2O2激活mTORC1活性又有H2O2抑制mTORC1活性的报道。二、ROS调控mTORC1的分子机制（一） ROS激活mTORC1的分子机制1.ROS可能通过PI3K激活mTORC1。PI3K的特异性抑制剂LY294002能阻断低浓度H2O2引起S6K1（T389）的激活,提示低浓度H2O2可能通过PI3K激活mTORC1;2.ROS激活mTORC1与TSC2无关。在TSC2基因敲除的胚胎成纤维细胞(TSC2-/-P53-/-MEF)中,与TSC2野生型细胞(TSC2+/+P53-/-MEF)一样,低浓度H2O2仍然能引起S6K1（T389）的激活,提示低浓度H2O2激活mTORC1与TSC2无关。（二） ROS抑制mTORC1的机制1.ROS通过磷酸酶2A（PP2A）抑制mTORC1。免疫共沉淀（Co-immunopricipitation,Co-IP）显示ROS可诱导HEK293细胞内源性PP2A催化亚基（PP2Ac）与S6K1相互作用;PP2A特异性抑制剂OKA能逆转高浓度H2O2引起的mTORC1（PS6K1（T389）、PS6（S235/236）、P4E-BP1（T37/46））的活性下降,提示高浓度H2O2通过激活PP2A而抑制mTORC1活性。此外,我们还发现低浓度H2O2可引起细胞增殖抑制,细胞周期阻滞在G2期,PP2A特异性抑制剂OKA能够逆转低浓度、长时间H2O2作用引起的MC3T3-E1细胞G2期阻滞。而高浓度H2O2引起细胞死亡,OKA也可明显抑制H2O2引起的细胞死亡进程。以上提示,高浓度或长时间H2O2可能通过激活PP2A抑制mTORC1,进而影响细胞周期与细胞存活。2.ROS激活AMPK,后者通过磷酸化Raptor（S792）抑制mTORC1;TSC2与Rheb不参与AMPK介导ROS抑制mTORC1。HEK293细胞中,AMPK（T172）、Raptor（S792）呈时间、剂量依赖地被H2O2磷酸化激活,mTORC1活性（P-S6K1（T389）、P-S6（S235/236）、P-4E-BP1（T37/46））受抑制。AMPK的特异性抑制剂compound C能够阻断H2O2引起的AMPK（T172）和Raptor（S792）的磷酸化,同时ROS引起的S6K1（T389）、S6（S235/236）、4E-BP1（T37/46）的磷酸化水平下降被逆转。这表明高浓度H2O2通过激活AMPK,进而磷酸化Raptor,从而抑制mTORC1活性。在TSC2-/-P53-/-MEF及TSC2+/+P53-/-MEF中,高浓度H2O2均能引起mTORC1（P-S6K1（T389）、P-S6（S235/236）、P-4E-BP1（T37/46））活性下降;Co-IP也发现H2O2并不引起AMPK与TSC2之间相互作用增强,说明高浓度H2O2对mTORC1的抑制与TSC2无关。HEK293细胞转染Rheb的活化型（Q64L）突变体和野生型（wt）质粒后,能够抵抗氨基酸饥饿引起的mTORC1活性下降,但不能抵抗H2O2引起的mTORC1活性下降,说明Rheb不参与这一过程,即高浓度H2O2抑制mTORC1与Rheb无关。因此,ROS激活AMPK,后者通过磷酸化Raptor（S792）而不是通过TSC2/Rheb抑制mTORC1。三ROS调控mTORC2信号及其分子机制1.ROS是mTORC2的快速高效激动剂。近年发现负责激活Akt（473）的激酶是mTORC2。在我们检测的多种细胞中,H2O2 5 min即显著激活Akt（S473）,随时间延长,15 min达到最大,2 h仍维持较高水平,4 h回到基础水平。不同浓度（0.2-5 mM）H2O2激活ATK（S473）呈浓度依赖性。因此H2O2是mTORC2（Akt（S473））的快速高效激动剂。2.ROS可能通过PI3K和NFκB/IKK激活mTORC2。H2O2通过什么途径激活mTORC2而引起AKT（S473）的快速磷酸化?由于mTORC2的上游信号通路还不清楚。H2O2可能参与ERK、NFκB/IKK、PI3K、PTK、PP2A等信号通路,因此,我们用特异性抑制剂阻断这些信号通路,发现PI3K/AKT的特异性抑制剂LY294002和NFκB/IKK的特异性抑制剂BAY11-7082能够阻断H2O2引起的AKT（S473）的磷酸化。这说明H2O2可能通过激活PI3K和NFκB/IKK而激活mTORC2。其它的抑制剂均不能阻断H2O2引起的AKT（S473）的磷酸化,说明H2O2激活mTORC2与ERK、PTK和PP2A信号无关。综上所述,ROS即可激活mTORC1活性,也可抑制mTORC1活性。这两种作用均表现出细胞依赖性、时间依赖性和浓度依赖性。低浓度H2O2通过PI3K激活mTORC1活性,但与TSC2无关。高浓度H2O2即可通过激活PP2A抑制mTORC1活性,也可通过磷酸化AMPK进而磷酸化raptor而抑制mTORC1活性。高浓度H2O2对mTORC1活性的抑制与TSC2和Rheb无关。H2O2通过PI3K和NFκB/IKK激活mTORC2,而与ERK、PTK和PP2A信号无关。本研究得到的以上结论为mTOR信号网络增添了新内容,为ROS和mTOR相关疾病发病机理和研发治疗药物提供了新的靶点选择。

全文目录


摘要  3-8
ABSTRACT  8-14
前言  14-21
第一部分 活性氧调节mTORC1信号及其分子机制  21-56
  1.1 材料与方法  21-31
  1.2 实验结果  31-56
第二部分 活性氧调节mTORC2信号及其分子机制  56-62
  2.1 材料与方法  56-58
  2.2 实验结果  58-62
讨论  62-70
全文小结  70-71
参考文献  71-80
在读期间发表论文  80-81
致谢  81-82

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 一般性问题 > 生化效应
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