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Myod1和Myog真核共表达载体构建及转染真皮成纤维细胞的实验研究

作　者: 高宏飞
导　师: 梁炳生
学　校: 山西医科大学
专　业: 外科学
关键词: 基因治疗 Myod1 Myog 成纤维细胞 皮肤 骨骼肌 萎缩 大鼠
分类号: R685
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：多年来，失神经支配骨骼肌萎缩始终是骨科学研究领域中的一个重要并亟需突破的理论难题，逆转骨骼肌纤维化的研究更加具有挑战性。目前，运用转录因子进行基因治疗是极具潜力和应用前景的治疗方法，也是各个学科前沿研究的热点。在调控骨骼肌发生、分化和成熟的过程中，生肌调节因子家族发挥着决定性作用。因此，应用生肌调节因子进行基因治疗以逆转骨骼肌纤维化，可能具有较高的研究价值。以前的研究结果显示，针对失神经骨骼肌萎缩，利用单一基因进行基因治疗可以发挥一定的治疗作用，但是，总地来说疗效不佳，需要进一步提高。由于生肌调节因子家族中的各个成员在发挥调控骨骼肌分化的作用时，具有相互协同和相互促进的作用，因此探索双基因联合应用进行基因治疗以逆转骨骼肌纤维化是一项很有价值研究课题，能够为防治失神经支配骨骼肌萎缩寻找新的思路，并且提供基础研究的实验依据。由于Myod1和Myog是生肌调节因子家族中最为重要的两个成员，因此，本研究选取Myod1和Myog作为研究对象，探讨二者联合基因转染对于诱导真皮成纤维细胞转分化成为成肌细胞的作用，以期为逆转失神经支配骨骼肌萎缩寻找新的治疗靶点。（1）通过克隆Myod1具基因和Myog基因的cDNA，构建Myod1和Myog各自的克隆载体，进一步构建Myod1和Myog二者的真核共表达载体，为下一步进行Myod1和Myog联合基因转染防治骨骼肌失神经萎缩的细胞学研究提供实验基础。（2）通过原代培养大鼠真皮成纤维细胞，为下一步进行Myod1和Myog真核共表达载体体外转染的细胞学实验提供理想的细胞基础。（3）应用Myod1和Myog真核共表达载体对原代培养的大鼠真皮成纤维细胞进行体外转染实验，检测转染后的真核共表达载体能否正确表达Myod1蛋白和Myog蛋白，观察并鉴定Myod1和Myog基因联合体外转染能否使来源于大鼠皮肤真皮层的成纤维细胞转分化成为成肌细胞，为逆转骨骼肌纤维化的治疗提供新的靶点。方法：（1）通过RT-PCR的方法克隆大鼠Myod1基因和Myog基因的全长cDNA，将Myod1和Myog的cDNA分别连接到克隆载体pMD18，构建重组的pMD18-Myod1和pMD18-Myog克隆载体，利用大肠杆菌扩增克隆载体，提取、纯化克隆载体，酶切克隆载体获得Myod1基因和Myog基因的cDNA，将二者依次插入到pVAX1载体中，构建出重组的Myod1和Myog真核共表达载体pVAX1-Myod1-IRES2-Myog-IRES2-EGFP，采用测序的方法对其进行鉴定，验证所构建的真核共表达载体的正确性。（2）从大鼠皮肤真皮层提取成纤维细胞，在分离、纯化后进行原代培养，然后对所培养细胞进行鉴定，采用免疫荧光及免疫细胞化学的方法检测细胞特异性成分Vimentin和Desmin，以确定所培养细胞种类为成纤维细胞。（3）应用转染试剂Lipofectamine2000作为媒介，将Myod1和Myog的真核共表达载体pVAX1-Myod1-IRES2-Myog-IRES2-EGFP对原代培养的大鼠真皮成纤维细胞进行转染，利用WesternBlot检测Myod1蛋白和Myog蛋白的表达，验证真核共表达载体能否正确表达目的蛋白；利用免疫荧光及免疫细胞化学方法对成纤维细胞是否能够发生转分化进行鉴定，明确Myod1和Myog的真核共表达载体体外转染能否使原代培养的大鼠真皮成纤维细胞转分化为成肌细胞。结果：（1）测序鉴定结果表明：重组的pMD18-Myod1和pMD18-Myog克隆载体中所克隆的Myod1和MyogcDNA的长度及碱基序列均正确，证实本实验所克隆的Myod1和MyogcDNA序列与Genebank所报道的序列一致。（2）测序鉴定结果表明：重组的Myod1和Myog真核共表达载体pVAX1-Myod1-IRES2-Myog-IRES2-EGFP内的Myod1和MyogcDNA的序列长度及碱基顺序均正确，证实本实验所克隆的Myod1基因和Myog基因的cDNA序列与Genebank所报道的序列一致。（3）Vimentin染色和Desmin染色检测结果表明原代培养的细胞是成纤维细胞，本实验所培养的细胞中没有出现Desmin染色阳性的成肌细胞。（4）在转染实验中，Western Blot能够检测到有Myod1蛋白和Myog蛋白的表达，证实Myod1和Myog的真核共表达载体体外转染成纤维细胞后能够正确表达Myod1蛋白和Myog蛋白。（5）在转染后的细胞内能够能够检测到Desmin染色阳性表达，证实Myod1和Myog真核共表达载体体外转染后能够使原代培养的大鼠真皮成纤维细胞转分化为成肌细胞。结论：（1）本研究正确克隆了Myod1和Myog的cDNA。（2）本研究正确构建了重组pMD18-Myod1克隆载体和重组pMD18-Myog克隆载体。（3）本研究正确构建了重组Myod1和Myog真核共表达载体pVAX1-Myod1-IRES2-Myog-IRES2-EGFP。（4）本研究能够从大鼠皮肤真皮层原代培养出纯度较高的成纤维细胞。（5）本研究所构建的重组Myod1和Myog的真核共表达载体在脂质体的介导下能够有效地转染到原代培养的大鼠真皮成纤维细胞内，并且能够表达结构正确的Myod1蛋白和Myog蛋白。（6）本研究所构建的重组Myod1和Myog真核共表达载体pVAX1-Myod1-IRES2-Myog-IRES2-EGFP在体外转染时，能够诱导大鼠真皮成纤维细胞转分化为成肌细胞。

全文目录


摘要  6-9
ABSTRACT  9-11
前言  11-20
  参考文献  15-20
第一部分 大鼠Myod1和Myog基因真核共表达载体的构建  20-57
  前言  20-22
  材料和方法  22-47
  结果  47-49
  讨论  49-53
  结论  53-54
  参考文献  54-57
第二部分 大鼠真皮成纤维细胞的体外培养及鉴定  57-73
  前言  57-58
  材料和方法  58-63
  结果  63-66
  讨论  66-70
  结论  70
  参考文献  70-73
第三部分 Myod1和Myog真核共表达载体转染大鼠真皮成纤维细胞的实验研究  73-98
  前言  73-74
  材料和方法  74-81
  结果  81-84
  讨论  84-91
  结论  91-92
  参考文献  92-98
全文结论  98
创新点  98-99
综述1 MRFs转录因子的研究进 展  99-123
  参考文献  115-123
综述2 失神经支配骨骼肌萎缩的发病机制及其治疗方法的研究进展  123-141
  参考文献  132-141
攻读学位期间发表文章情况  141-142
致谢  142-143
作者简历  143

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 骨科学（运动系疾病、矫形外科学） > 肌肉疾病及损伤
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