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人类乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式调节新基因PS1TP5的克隆表达与部分功能研究

作　者: 张健康
导　师: 赵龙凤；成军
学　校: 山西医科大学
专　业: 内科学
关键词: 乙型肝炎病毒 前-S1蛋白 反式调节蛋白 酵母双杂交 抑制性消减杂交
分类号: R346
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


乙型肝炎病毒的持续感染至今仍然是一个全球性的健康问题,不仅引起急慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生发展密切相关。然而对于HBV感染目前尚无特效的治疗方法,这主要是由于HBV感染引起病毒性肝炎的发病机制尚不清楚。目前认为,HBV进入肝细胞后,病毒基因组及其编码的蛋白与肝细胞基因及蛋白之间的相互作用是决定HBV复制、表达、免疫逃逸、慢性感染、肝纤维化及致恶性转化的关键因素。特别是近年来随着对HBV致病机制研究的深入,发现在HBV与肝细胞相互作用的过程中涉及到复杂的反式调节机制,肝炎病毒蛋白在肝细胞中的表达对于肝细胞的基因表达谱产生影响,这一作用可能与其致病机制有关。因此,寻找肝细胞中与HBV各抗原成分反式调节的相关基因,并进一步研究它的作用机制、作用效应及相互影响,对明确HBV的致病机制,寻找有效防治方法具有重要意义。对于筛选得到的未知功能基因的克隆表达与功能研究是病毒性肝炎发病机制研究领域中创新知识的重要源泉,同时也是人类基因组计划和后基因组计划的重要内容。本研究利用转染了HBV前-S1蛋白基因片段表达载体的肝细胞和仅转染空载体的肝细胞为材料,提取其mRNA应用SSH技术研究了HBV前-S1蛋白的反式调节靶基因,筛选得到一未知功能基因,经斑点杂交技术验证后,确定其基因编码序列,命名为乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式调节蛋白5（PS1TP5）,GenBankAccession:AY427953。发现一种新基因,将其编码的新蛋白结构与生物学功能,与生物学和临床医学之间的相互关系,以及表达调控机制阐明,是目前分子生物学研究领域中最具有挑战性的工作。为此本研究做了以下四方面工作。1.提取HepG2细胞mRNA,利用RT-PCR方法在PS1TP5基因的两端分别引入EcoRI和BglⅡ酶切位点,获得了438bp的目的基因片段,连接至pGEM-T载体,测序正确后插入至原核表达载体pET-32a（+）中,转化BL21宿主菌,1 mmol/LIPTG在30℃诱导2h、3h、4h后均获得了带有组氨酸标签的重组融合蛋白的表达。2.利用ExPASy proteomics server对PS1TP5进行蛋白理化性质与结构功能预测分析。PS1TP5相对分子量为15853.4,理论pI为9.41,不同条件下的消光系数为17335 M-1cm-1或16960 M-1cm-1（280nm）,在体外哺乳动物网状细胞中的半寿期为30hr,并且无卷曲螺旋区域,但具有4个疏水区;无特殊二级结构,有3个蛋白激酶磷酸化位点,不具有跨膜螺旋结构,无信号肽,定位于细胞浆中。3.将引入EcoRI和BglⅡ酶切位点的PS1TP5基因片段插入至酵母细胞表达载体pGBKT7中,转化AH109酵母菌株并获得表达,与含有白细胞文库质粒的Y187酵母菌株配合,进行酵母双杂交筛选获得了与PS1TP5具有相互作用的已知功能蛋白23种,包括白细胞黏附蛋白p150,95、白介素2受体γ链、PALM2-AKAP2蛋白、真核翻译起始因子4A、β2微球蛋白、钠-氢交换溶质载体家族9、无唾液酸糖蛋白受体1（ASGR1）、钙网织蛋白、MHC类Ⅱ型淋巴细胞抗原、细胞色素C氧化酶亚型1、淋巴细胞抗原86（LY86）、淋巴细胞溶质蛋白1等。结果提示PS1TP5可能参与肝细胞增殖分化、信息传递以及生长代谢。此外还筛选得到一个新基因,命名为乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白5结合蛋白1（PS1TP5BP1）,GenBank accession为DQ471327。4.构建pcDNA3.1/myc-His（-）A-PS1TP5真核表达重组质粒,与空质粒分别转染HepG2细胞,两者互为平行对照,提取转染后的细胞mRNA,成功地构建了PS1TP5蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库,筛选获得了23条已知的反式上调基因,包括信号转导分子:跨膜蛋白家族4超家族成员1（TM4SF1）、溶质载体家族7成员5（SLC7A5）、磷酸肌醇酶2（IMPA2）、信号序列受体-β、环氧化物酶1、蛋白激酶BRPK等;蛋白因子:核糖体蛋白S16、核糖体蛋白LP0、核糖体蛋白LP2、核糖体蛋白S7、核糖体蛋白L31、丛生蛋白转录突变体1等;转录因子:真核延伸因子1;能量代谢有关的酶:NADH脱氢酶1、肝丙酮酸脱氢酶、细胞色素C氧化酶亚单位8A、烯醇酶1、腺苷脱氨酶等。结果提示PS1TP5可能参与人类免疫调节、物质代谢、信号转导。特别是与肝纤维化形成、肿瘤发生发展有密切关系。此外还筛选得到一个新基因,命名为乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白5反式激活蛋白1（PS1TP5TP1）,GenBankaccession为DQ487761。

全文目录


摘要  8-11
Abstract  11-15
前言  15-20
第一部分 PS1TP5的基因克隆与原核表达  20-36
  一、材料与方法  20-29
    1.材料  20-21
      1.1 细胞株与菌株  20
      1.2 质粒  20
      1.3 试剂  20-21
      1.4 引物合成及DNA测序  21
    2.方法  21-29
      2.1 引物设计  21
      2.2 RT-PCR方法扩增PS1TP5基因  21-23
        2.2.1 提取HepG2细胞总RNA  21
        2.2.2 RT-PCR  21-23
      2.3 回收PS1TP5基因片段  23
      2.4 构建pET-32a(+)-PS1TP5原核表达质粒  23-27
        2.4.1 连接构建pGEM-T-PS1TP5克隆载体  23-25
        2.4.2 连接构建pET-32a(+)-PS1TP5表达载体  25-27
      2.5 PS1TP5重组蛋白的诱导表达  27-29
        2.5.1 SDS-PAGE  27-28
        2.5.2 Western Blotting检测PS1TP5  28-29
  二、结果  29-34
    1.RT-PCR方法扩增PS1TP5基因  29-30
    2.pGEM-T-PS1TP5阳性转化子的菌液PCR筛选与双酶切鉴定  30-32
    3.pET-32a(+)-PS1TP5阳性转化子的菌落PCR筛选与双酶切鉴定  32-33
    4.PS1TP5重组蛋白的表达与Western blotting检测  33-34
  三、讨论  34-36
第二部分 PS1TP5的部分功能研究  36-77
  第一节 PS1TP5的理化性质与结构功能预测分析  36-39
    一、方法  36-37
    二、结果  37-38
    三、讨论  38-39
  第二节 PS1TP5相互作用蛋白的筛选分析  39-57
    一、材料与方法  39-47
      1.材料  39-40
        1.1 菌株  39
        1.2 载体  39
        1.3 试剂  39
        1.4 引物合成及DNA序列测定  39-40
      2.方法  40-47
        2.1 引物设计  40
        2.2 RT-PCR方法扩增PS1TP5基因  40
        2.3 构建pGBKT7-PS1TP5酵母细胞表达质粒  40-41
          2.3.1 连接构建pGEM-T-PS1TP5克隆载体  40
          2.3.2 连接构建pGBKT7-PS1TP5表达载体  40-41
        2.4 pGBKT7-PS1TP5转化AH109酵母细胞  41-42
        2.5 PS1TP5在AH109酵母细胞中的表达  42-44
          2.5.1 提取酵母细胞总蛋白  42-43
          2.5.2 SDS-PAGE及Western Blotting检测PS1TP5表达  43-44
        2.6 酵母双杂交技术筛选白细胞cDNA文库中与PS1TP5相互作用蛋白  44-47
          2.6.1 酵母双杂交筛选  44-45
          2.6.2 酵母质粒电转化大肠埃希菌  45-47
    二、结果  47-55
      1.RT-PCR方法扩增PS1TP5基因  47
      2.pGEM-T-PS1TP5阳性转化子的菌液PCR筛选与双酶切鉴定  47-48
      3.pGBKT7-PS1TP5阳性转化子的菌落PCR筛选与双酶切鉴定  48-49
      4.pGBKT7-PS1TP5阳性转化酵母的菌落PCR筛选  49-50
      5.酵母细胞蛋白的Western Blotting检测  50-51
      6.酵母双杂交筛选阳性文库质粒  51-52
      7.阳性文库质粒的酶切鉴定  52-55
    三、讨论  55-57
  第三节 PS1TP5反式调节基因的筛选分析  57-77
    一、材料与方法  57-68
      1.材料  57
        1.1 菌株  57
        1.2 质粒  57
        1.3 试剂  57
        1.4 引物合成及DNA序列测定  57
      2.方法  57-68
        2.1 构建pcDNA3.1/myc-His(-)A-PS1TP5真核表达质粒  57-58
        2.2 pcDNA3.1/myc-His(-)A-PS1TP5转染细胞  58-60
          2.2.1 磁珠法提取pcDNA3.1/myc-His(-)A-PS1TP5及pcDNA3.1/myc-His(-)A空载体转染级质粒  58-60
          2.2.2 pcDNA3.1/myc-His(-)A-PS1TP5及pcDNA3.1/myc-His(-)A空载体转染HepG2细胞  60
        2.3 抑制性消减杂交技术筛选PSlTP5反式调节基因  60-68
          2.3.1 提取转染细胞mRNA  60-61
          2.3.2 合成双链cDNA(dscDNA)  61-62
          2.3.3 消减杂交文库的建立  62-67
          2.3.4 PCR产物的克隆、鉴定及分析  67-68
    二、结果  68-74
      1.pcDNA3.1/myc-His(-)A-PS1TP5阳性克隆菌落PCR筛选与双酶切鉴定  68-70
      2.mRNA的定性定量分析  70
      3.接头连接效率的检测  70-71
      4.cDNA消减文库消减效率的鉴定  71-72
      5.差异表达cDNA片段的鉴定  72-73
      6.DNA测序及同源性分析  73-74
    三、讨论  74-77
结论  77
进一步需要研究的问题  77-78
参考文献  78-86
攻读学位期间主要研究成果  86-92
攻读学位期间已发表及待发表论文  92-94
致谢  94

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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