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凝血及抗凝血因子与静脉血栓栓塞和心肌梗死关系的初步研究

作　者: 韩轩茂
导　师: 杨林花
学　校: 山西医科大学
专　业: 血液内科学
关键词: 静脉血栓栓塞 心肌梗死 凝血因子 抗凝血因子 基因多态性
分类号: R542.22
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


血栓性疾病(thromboembolism)是人类发病率和死亡率最高的疾病之一,分为静脉血栓栓塞和动脉血栓性疾病。静脉血栓栓塞(venous thromboemblism,VTE)临床主要表现为深静脉血栓(deep venous thrombosis,DVT)和肺栓塞(pulmonarythromboemblism,PTE);而动脉血栓性疾病(arterial thrombosis)包括冠心病(coronaryheart disease,CAD)、缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS)和周围动脉疾病(peripheralarterial occlusion,PAO)。CAD发病中血栓形成是一个关键环节,许多生物化学途径相互作用导致动脉壁内斑块形成及斑块不稳定、斑块破裂最终血栓形成,引起血管阻塞、组织坏死和心肌梗死(myocardial infarction,MI),产生严重临床后果。近20年来的研究发现,血浆凝血因子水平升高和/或抗凝血因子水平降低与静脉和/或动脉血栓形成密切相关,为血栓形成的危险因子。现在认为蛋白C(protein C,PC)、蛋白S(protein S,PS)和抗凝血酶(antithrombin,AT)缺乏,凝血因子(coagulationfactor,F)如FⅡ、FⅤ、FⅧ、FⅨ、纤维蛋白原水平(fibrinogen,Fg)升高,D-dimer(D-D)升高,高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia,HHc)和活化蛋白C抵抗(activated protein Cresistance,APCR)现象可能与血栓性疾病有关。但众多临床及流行病学研究结果并不一致,各种凝血因子和/或抗凝血因子在血栓性疾病中的作用仍存在争议。尽管遗传因素和环境因素相互作用在血栓性疾病的发病过程中起重要作用,但是约有半数以上的患者可无环境因素,随着人类基因组学研究的进展,人们将注意力集中在血栓形成分子遗传学研究上,并且发现了部分与血栓形成可能相关的基因多态性。如β-纤维蛋白原-455G/A和-148C/T,FⅡG20210A与FⅡA199l 1G,FⅤLeinden、FⅤCambridge、FⅤHong Kong、FⅤASP79HIS(G409C)和FⅤI359T,PC-1476A/T和-1654C/T,亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因677C/T、1298A/C、1793G/A和1317T/C多态性。但这些多态性在不同种族和地域人群中存在非常大的差异,同时这些多态性与临床表型之间的相关性亦存在争论,它们在动脉血栓性疾病与静脉血栓性疾病中的作用也不尽相同。本研究通过对95例VTE患者、95例急性心肌梗死患者(acute myocardial infarction,AMI)和95健康对照者进行凝血和抗凝血因子活性或含量测定,探讨这些凝血因子和抗凝血因子与VTE及AMI的关系;对多个基因多态性同时进行分析,检测与上述凝血因子和抗凝血因子相关的基因多态性在VTE、AMI和健康人中的分布,研究这些基因多态性在血栓性疾病中的分布,基因多态性与表型以及基因多态性联合作用与表型的关系,探讨VTE和AMI发生的主要遗传学危险因素,以进一步研究VTE和AMI的发病机制。本研究采用发色底物法测定AT,PC活性:凝血法检测血浆Fg浓度;免疫比浊法测定D-D水平;APC-APTT法检测APCR。凝血一期法测定患者血浆FⅡ、FⅤ、FⅧ、FⅨ活性。利用多聚酶链反应-限制性内切酶长度多态性(polymerase chain reaction-restrictionfragment length polymorphism,PCR-RFLP)技术检测FⅤLeiden、FⅤCambridge、FⅤHongKong和FⅡG20210A突变;采用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaser desorption ionization/time-of flight mass spectrometry,MALDI-TOF)技术检测β-纤维蛋白原基因-455G/A和-148C/T,FⅡ基因A19911G,FⅤ基因ASP79HIS(G409C)和FⅤI359T,PC-1476A/T和-1654C/T,MTHFR基因C677T、A1298C、T1317C和G1793A多态性。研究结果显示,与对照组相比,VTE组Fg含量为(4.49±2.41 g/L vs 3.26±0.83 g/L,P＜0.001)、D-D含量(0.68±0.49 mg/L vs 0.18±0.12 mg/L,P＜0.001)、FⅡ:C(100.88%±23.67%vs 93.24%±26.08%,P=0.036)、FⅤ:C(108.03%±28.29%vs 81.33%±28.15%,P＜0.001)、FⅧ:C(109.56%±35.06%vs 109.56%±35.06%,P＜0.001)水平均明显增高;FⅨ:C(90.61%±18.00%vs 84.73%±32.82%,P=0.363),差异无显著性:PC:A(98.77%±24.63%vs 108.78%±37.23%,P=0.077)和AT:A(102.53%±22.53%vs 105.85%±23.68%,P=0.063)无统计学意义。在AMI组,Fg含量为(4.00±0.83 g/L vs 3.26±0.83 g/L,P＜0.001)、D-D含量(0.36±0.41 mg/L vs 0.18±0.12 mg/L,P=0.020)、FⅤ:C(92.97%±32.25%vs 81.33%±28.15%,P=0.034)、FⅧ:C(106.05%±32.14%vs 109.56%±35.06%,P＜0.001)水平均明显增高,而FⅡ:C(98.02%±22.40%vs 93.24%±26.08%,P＞0.050)和FⅨ:C(89.77%±21.75%vs84.73%±32.82%,P=0.4433)虽升高,但差异无显著性:而PC:A(94.70%±25.52%vs 108.78%±37.23%,P=0.077)和AT:A(102.52%±13.39%vs 105.85%±23.68%,P=0.481)水平虽有降低,但无统计学意义(P＞0.05)。β-纤维蛋白原基因-148C/T和-455G/A连锁不平衡分析发现,-148C/T和-455G/A两多态性位点呈完全连锁不平衡。应用One Way ANOV分析发现,对照组,血浆Fg水平呈-148CC＜-148CT+-148TT趋势,P值为0.039;而VTE组血浆Fg水平在两组间无差异,P值0.644;应用General Factorial ANOV方法在对照组中将不同基因型与年龄和性别一并考虑进一步分析发现血浆Fg水平不受不同基因型的影响(P=0.051);在AMI组,血浆Fg水平均呈-148CC＜-148CT+-148TT趋势,P值为0.039;AMI组不同基因型血浆Fg水平均仍然有统计学意义(P＜0.05),而所有研究对象合并后,应用One Way ANOV分析P值为0.011,GeneralFactorial ANOV方法分析P值为0.014,差异有统计学意义。与对照组相比,VTE组β-纤维蛋白原-148C/T位点常见基因型-148CC的分布频率降低,杂合子-148CT和少见型-148TT的分布频率升高,但组间分布没有统计学差异(P＞0.05);等位基因频率分析可见,稀有等位基因T的分布频率在VTE组为0.245,而在对照组为0.151,组间比较,差异有显著性(P=0.023)。β-纤维蛋白原-148C/T位点常见基因型-148CC、杂合子-148CT和少见型-148TT的分布频率以及等位基因频率在AMI组和对照组间分布没有统计学差异(P＞0.05)。对FⅡ基因G20210A和A19911G多态性分布及其与FⅡ:C的相关性行分析,三组均未发现G20210A多态性:A19911G等位基因型分布如下,对照组GG型55.9%,AG型44.1%,AA型0.0%,G等位基因和A等位基因频率分别为78.0%和22.0%:VTE组GG型75.8%,AG型23.1%,AA型1.1%,G等位基因和A等位基因频率分别为87.4%和12.6%,在去除年龄和性别混杂因素后,A19911G位点G等位基因和A等位基因与VTE仍然有相关性(P＜0.05):而在AMI组上述等位基因型及G等位基因和A等位基因频率分布与对照组无统计学差异,A19911G各基因型(AG+AA组vs GG组)组间FⅡ:C水平在对照组、VTE组及AMI组均无差异显著性。VTE组APCR阳性13例(20.0%),对照组3例(5.0%),二组比较有统计学意义(P=0.012);AMI组APCR阳性5例(7.7%),与对照组比较无统计学意义。所有检测对象均未发现FⅤLeiden、FⅤCambridge、FⅤHong Kong、FⅤAsp79His和FⅤ1359T多态性。PC-1654C/T三种基因型-1654CC、-1654CT和-1654TT在VTE分别为24.2%,45.1%和30.8%,在对照组分别为15.1%、54.8%和30.1%。-1654C等位基因频率在VTE组和对照组分别为46.2%和41.4%,而-1654T等位基因频率在VTE组和对照组分别为53.3%和57.5%。PC-1654C/T基因型和等位基因频率组间比较差异均无显著性(P＞0.05)。PC-1654C/T三种基因型-1654CC、-1654CT和-1654TT在AMI分别为14.1%,55.4%和30.4%,-1654T等位基因频率在AMI组和对照组分别为58.2%和57.5%。PC-1654C/T基因型和等位基因频率组间比较差异均无显著性(P＞0.05)。-1476A/T三种基因型-1476AA、-1476AT和-1476TT在VTE组分别为60.4%、28.6%和11.0%,在对照组分别为68.5%、30.4%和1.1%。-1476TT频率在VTE组高于对照组,组间比较有统计学意义(P=0.005);其他2种基因型组间分布无差异性(P＞0.05)。-1476 A等位基因频率在VTE组和对照组分别为74.7%和84.6%;-1476T等位基因频率在VTE组和对照组分别为25.3%和16.3%,组间比较差异有显著性(P=0.030)。1476A/T三种基因型-1476AA、-1476AT和-1476TT在AMI组分别为73.1%、26.9%和0.0%,与对照组比较3种基因型组间分布无差异性(P>0.05)。-1476 A等位基因频率在AMI组为86.6%;-1476T等位基因频率在AMI组为13.4%,与对照组间比较差异无显著性(P=0.903)。正常人PC-1654C/T和PC-1476A/T两多态性配对统计,发现PC-1654C/T和PC-1476A/T两多态性的PC-1654T和PC-1476A;PC-1654C和PC-1476T相连锁;上述连锁基因占全部基因组合数的百分率为52.7%,为不完全连锁不平衡。PC-1654C/T和-1476A/T多态性单倍型在对照组与VTE组分布,TT/CC纯合子在对照组与VTE组间分布不同,对照组1/91例(1.1%),VTE组10/89例(11.2%),差异有显著性(P＜0.05):其他单倍型在对照组与VTE组分布无统计学差异(P＞0.05)。三种主要连锁单倍型在对照组与AMI组AA/TT、AT/CT和TT/CC在两组间分布未见差异;其他单倍型在两组间分布无统计学差异(P＞0.05)。在VTE组、AMI组及对照组中,血浆PC活性均与PC-1654C/T多态性(CC型、CT型和TT型)之间均无相关性;PC-1476A/T多态性(AA型和AT+TT型)之间均无相关性;三种主要连锁单倍型AA/TT、AT/CT和TT/CC与血浆PC活性水平在三组均未见差异(P＞0.05)。所有检测样本均未发现MTHFR基因1317T/C多态性,1298A/C在正常人中的基因型分布分别为AA型75.0%、AC型23.9%和CC型1.1%,A、C等位基因频率为87.0%和13.0%;1793G/A多态性在正常人的分布GG、GA和AA分别为85.0%、8.0%和1.0%,G、A等位基因频率为95.7%和4.3%;上述两基因多态性在对照组及VTE患者间频率的分布无显著性差异,而1298A/C多态性、1793G/A等位基因型及频率分布在对照组和AMI组间比较差异有显著性。对正常人MTHFR基因1298A/C和1793G/A连锁不平衡分析显示,1298A和1793G、1298C和1793A相连锁,根据前述的基因频率分布可知,1298A、1793G为最常见的单倍体,1298C和1793A为较少见的单倍体。在对照组出现上述组合的连锁基因频率为0.84。上述各基因多态性联合突变中有部分在VTE组、AMI组及对照组的分布存在一定差异,但发生率较低。本研究结论如下:1.VTE和AMI是由多种凝血因子活性增高而导致的高凝状态,凝血因子联合作用在VTE和AMI发病中起主要作用,凝血因子“功能增加”可能是VTE和AMI更常见的危险因素。2.VTE和AMI均存在APCR现象,APCR与VTE有相关性,支持APCR现象和FVLeinden是导致VTE的两种独立危险因素。3.β-纤维蛋白原-455G/A和-148C/T存在完全连锁不平衡;-148C/T多态性与血浆Fg含量有相关性,但易受其它因素影响;-148C/T多态性与VTE有关,而与AMI不存在相关性。4.FⅡG20210A与VTE和AMI无相关性;FⅡA19911G多态性与FⅡ:C间不存在相关性;而FⅡA19911G多态性在VTE和AMI发病中的作用有待进一步研究。5.所有检测对象均未发现FⅤLeinden、FⅤCambridge、FⅤHong Kong、FⅤASP79HIS(G409C)和FⅤI359T突变,血浆FⅤ:C水平与这些突变无关;APCR与这些突变不存在相关性;这些突变在VTE和AMI发病中不起主要作用。6.PC-1476A/T和-1654C/T多态性间存在松散的连锁关系;-1476A/T和-1654C/T与血浆PC活性无关;PC-1654C/T多态性与VTE无关,-1476A/T多态性与VTE有相关性;而PC-1476A/T和-1654C/T多态性与AMI无相关性。7.未发现MTHFR基因1317T/C多态性;1298A/C和1793G/A多态性存在紧密连锁不平衡;1298A/C和1793G/A多态性与VTE无相关性而与AMI有关。8.基因多态性在AMI和VTE发病过程中存在协同作用,但发生率较低;选择恰当的基因间多态性进行研究,具有非常重要意义。

全文目录


主要缩略词  5-6
中文摘要  6-10
英文摘要  10-16
前言  16-18
第一部分 对象与方法  18-27
  1.1 临床资料  18
  1.2 实验仪器  18-19
  1.3 试剂  19-21
  1.4 数据库网站和分析软件  21-22
  1.5 实验方法  22-26
  1.6 统计学方法  26-27
第二部分 结果  27-49
  2.1 凝血、抗凝因子检测结果  27
  2.2 凝血、抗凝血因子基因多态性检测结果  27-49
第三部分 讨论  49-67
第四部分 结论  67-68
参考文献  68-81
综述  81-87
  正文  81-85
  参考文献  85-87
个人简介  87-89
致谢  89

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 心脏、血管（循环系）疾病 > 心脏疾病 > 心肌疾病 > 心肌梗塞
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