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研究目的:将经过抑肽酶和氨甲环酸改良的纤维蛋白胶(FG)支架复合软骨细胞,利用旋转培养仪进行软骨细胞—支架复合物模拟微重力培养,观察模拟微重力对软骨细胞-改良纤维蛋白胶支架复合物在体外构建的影响,了解改良支架材料的降解特性以及组织工程软骨细胞外基质分泌的情况,观察细胞、支架复合物在体内实验修复关节软骨缺损的相关情况,探索模拟微重力下改良软骨模块修复关节软骨缺损的效用及其可能的临床应用价值。研究方法:一、动物体外实验部分:1.取3周龄新西兰幼兔的关节软骨制取软骨细胞,体外单层培养扩增,收集4代以内的软骨细胞作为种子细胞,种植于改良纤维蛋白胶支架上,构建细胞改良纤维蛋白胶支架复合物。2.将复合物分成两组:旋转培养组和普通对照组。旋转培养组利用旋转培养仪进行模拟微重力培养;普通对照组在24孔板中静止培养,均连续在体外进行三维立体培养、扩增2周。观察复合物大体情况,测量湿重;观察软骨细胞的形态变化,绘制细胞生长曲线,光镜、扫描电镜和透射电镜下的形态学观察和组织学观察(HE染色、阿利新蓝染色)以及Ⅱ型胶原免疫组化检测、氨基多糖(GAG)的测定,了解模拟微重力对改良纤维蛋白胶软骨细胞复合物培养的影响。二、动物体内实验部分:将48只双侧膝关节软骨缺损的3月龄新西兰兔动物模型随机分为四组。在A组、B组和C组的关节软骨缺损中分别植入在模拟微重力下培养的细胞改良FG支架复合物、普通环境培养下的细胞改良FG支架复合物以及无细胞的单纯改良FG支架,D组为空白对照组。术后第2、6、12周取材,进行大体评测,组织形态学及超微结构观察,并观察载体降解情况,于第12周标本按照Wakirani标准进行组织工程学评分,然后对所得数据进行统计学处理。研究结果:一、体外实验部分:1.经体外培养1周和2周,两组支架材料复合物基本保持了复合物的大小和形状,湿重测定经统计学处理无显著差异。2.改良支架的复合物经体外培养2周,组织学及Ⅱ型胶原免疫组化检测,显示两组均有大量软骨细胞生成,细胞周围有酸性粘多糖沉积和特异性Ⅱ型胶原表达,软骨组织长势良好。3.普通培养组细胞倍增时间为5.1天,旋转培养组为4.7天。4.相对于普通培养组,模拟微重力能刺激软骨细胞代谢,基质的外分泌,Ⅱ型胶原和GAG的合成量均增加,GAG含量在第2周出现显著性差异,显示模拟微重力环境下培养的软骨细胞-改良纤维蛋白胶支架复合物质量较好。二、体内实验部分:1.术后第2周,A、B、C各实验组内可见种植的软骨模块,边界清楚,与周围组织未融合,无一例种植块脱落。空白组内只见少许淤血块。2.术后第6周,旋转培养组可见不典型的透明软骨组织,软骨细胞位于陷窝中,细胞数量较多,排列较为规则,可见分区,阿利欣蓝染色阳性基质含量较高,局部可见少许淋巴细胞浸润,关节软骨缺损部修复面约为正常软骨的2/3—3/4,表面较为平整;普通培养组亦可见不典型透明软骨组织,软骨细胞位于陷窝中,细胞数量较多,排列不规则,阿利欣蓝染色阳性基质较前组为少,修复面平整,修复组织厚度大约为邻近软骨的1/2～2/3;单纯支架组为纤维组织覆盖,表面凹凸不平,凹陷明显,周围边界清楚,在单纯支架组偶有类纤维软骨形成,并有吞噬降解材料的巨噬细胞出现;在完全空白组表面可见一薄层组织敷盖,主要为纤维疤痕及炎性组织敷盖。3.术后第12周,旋转培养组修复软骨与邻近软骨整合紧密、厚度相近、细胞位于软骨陷窝中,数量较正常软骨为多,富含阿利欣蓝染色阳性基质,修复软骨结构与正常软骨相似,表层细胞呈椭圆形,长轴与关节面平行,中间细胞呈圆形,放射区内细胞有柱状排列趋势;普通培养组亦可见部分透明软骨组织,软骨细胞位于陷窝中,细胞数量尚可,排列欠规则,阿利欣蓝染色阳性基质较前增多,修复面较为平整,部分修复组织厚度大约为邻近软骨3/4;单纯支架组缺损区内大部为纤维组织覆盖,其下为软骨下骨,修复组织与邻近组织边界较为清楚,表面不平,偶见软骨细胞;完全空白组内为松散的纤维疤痕组织敷盖及部分炎性细胞的存在。4.术后第12周按照Wakirani标准评分,修复关节软骨效果由好至差的顺序为旋转培养组的细胞改良FG支架复合物组、普通培养组的细胞改良FG支架复合物组、单纯改良FG支架、空白对照组。评分通过统计学处理各组之间存在显著性差异。结论:1.旋转培养仪提供的模拟微重力环境,可以使软骨细胞高密度生长并能促进其分泌基质,从而提高了组织工程化软骨的质量。2.经过改良的纤维蛋白胶支架,其降解速率与软骨组织基质形成同步,能长时间支持体内、外软骨组织的形成,并适合旋转培养,是软骨组织工程中适宜的支架。3.模拟微重力环境能提供类似于组织在体内环境,随着寻求最优化的体外培养环境,该技术也为实现关节软骨损伤的修复提供新的有效途径。
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