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双层胶原/大孔径PLA纳米纤维支架用于关节骨软骨组织工程的研究

作　者: 陈隆坤
导　师: 欧阳宏伟
学　校: 浙江大学
专　业: 运动医学
关键词: 骨软骨组织工程软骨修复纳米纤维双层支架软骨下骨
分类号: R873
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景：随着全球老龄人口和运动创伤的增加,关节软骨损伤的发病率在提高,影响着全球数千万人的健康。关节软骨损伤分为三种类型：部分软骨损伤,全层软骨损伤和骨软骨损伤,其中骨软骨损伤占所有软骨损伤的5%。关节软骨是没有血管、淋巴管和神经分布的组织,损伤后自我修复能力差,对临床骨科和运动医学构成挑战。过去几十年的研究主要集中在关节软骨层的修复和再生,对软骨下骨的研究并未引起足够的重视。现在逐步认识到软骨下骨的修复和重建对骨软骨单位的修复和功能维持起到重要作用。本研究设计了两种组织工程骨软骨支架促进关节骨软骨缺损修复及其机制研究。本研究分为三个部分：(1)构建用于骨软骨修复的双层支架；(2)双层骨软骨支架的生物学检测(3)双层支架原位修复骨软骨缺损及其机制探讨。本研究探索了不同双层支架对骨软骨缺损修复的效果,提出了对骨软骨支架设计的新认识,探讨了本支架在原位骨软骨修复的再生机制。第一部分构建用于骨软骨修复的双层支架目的：本部分研究的主要目的是构建两种骨软骨双层支架,为检测支架的生物学特征和原位骨软骨缺损修复提供研究手段。方法：分离纯化猪肌腱来源的I型胶原,分步冻干法制作上层疏松下层致密的双层胶原支架(COL-COL).高压静电纺丝技术制作二维聚乳酸纳米纤维,冰冻切片法将二维纳米膜切成“微米条”。模具内分步冻干法制作上层胶原,下层大孔径聚乳酸纳米纤维双层支架(COL-PLA).扫描电镜法观察材料的孔径。结果：本部分研究构建了两种双层支架,每种支架的尺寸根据体外检测和原位修复的不同用途,分为两种规格。用于原位修复的双层支架大小规格为：直径4mm,高度4mm,上下层的厚度均为2mm。用于体外检测的双层支架的大小规格为：直径15mm,高度2mm。双层材料的厚度分别为1mm。扫描电镜检测COL-COL支架的上层孔径为100-300um,下层孔径为50-150um。COL-PLA支架的胶原孔径为50-150um,PLA层孔径为100-300um。结论：两种双层骨软骨支架符合体外生物学检测和体内原位骨软骨修复的需求。第二部分双层骨软骨支架的生物学检测目的：本部分研究主要检测在体外实验中双层骨软骨支架的细胞粘附性能和骨向诱导分化情况。方法：人和兔骨髓间充质干细胞(hBMSC和rBMSC)经分离和在双层支架上培养后,用扫描电镜(SEM)检测细胞在双层支架上的粘附,MTT法检测细胞在双层支架上的增殖,von Kossa法检测细胞在双层支架上的钙结节的富集,realtime-PCR法检测细胞在双层支架上的骨向分化基因的表达。结果：SEM观察显示细胞在胶原和PLA支架上均有良好的粘附,胶原的粘附大于PLA。MTT检测显示细胞在两种双层支架上都呈现出较强的增殖能力。von Kossa检测显示COL-PLA支架比COL-COL支架的颜色更黑,说明COL-PLA富集了更多的钙结节。realtime-PCR结果显示骨向分化基因OCN和Runx2在COL-PLA支架上的表达更高。结论：两种支架对细胞具有良好的粘附性。COL-PLA支架比COL-COL支架具有更强的骨向诱导潜能。第三部分两种双层支架体内原位修复兔膝关节骨软骨缺损目的：本部分研究主要探索两种双层支架原位修复骨软骨缺损的效果及其可能的修复机制,发掘对骨软骨支架设计的新认识,为支架进入临床应用做前期基础研究。方法：23只新西兰兔分为3个组,分别为未处理组(Non-treated)、COL-COL组、COL-PLA组。在双侧膝关节股骨滑车处制造骨软骨缺损(深度3.5-4mm,直径4mm)。采用COL-COL支架致密层和COL-PLA支架PLA层朝下的方式,术中植入缺损处。分别于术后6w和12w麻醉处死动物,进行大体观察及评分、组织学切片及评分、力学测试和micro-CT检查,并对量化结果进行统计学分析。结果：经过结构和功能的综合观察评估,COL-PLA组获得了最高的得分COL-COL组其次,Non-treated组最差。进一步以骨软骨作为分析对象,COL-PLA组比另外两组形成了更厚的以松质骨为主的软骨下骨,形成了更厚的以透明软骨为主的软骨层。结论：COL-PLA支架能很好的修复关节骨软骨缺损,是有临床应用前景的骨软骨组织工程支架。

全文目录

致谢  4-5
中文摘要  5-8
ABSTRACT  8-12
目次  12-15
引言  15-18
1 第一部分构建用于骨软骨修复的双层支架  18-24
  1.1 实验材料  18-19
    1.1.1 材料和试剂  18
    1.1.2 实验仪器及材料  18
    1.1.3 相关溶液的配制  18-19
  1.2 试验方法  19-22
    1.2.1 双层胶原支架(COL-COL)的制备  19-20
    1.2.2 胶原/微米孔径聚乳酸纳米纤维支架(COL-PLA)的制备  20-22
  1.3 实验结果  22-23
    1.3.1 双层COL-COL支架的扫描电镜(SEM)  22
    1.3.2 双层COL-PLA支架的扫描电镜(SEM)  22-23
  1.4 讨论  23-24
2 第二部分双层骨软骨支架的生物学检测  24-32
  2.1 实验材料  24-25
    2.1.1 材料和试剂  24
    2.1.2 实验仪器及材料  24
    2.1.3 相关溶液的配制  24-25
  2.2 试验方法  25-29
    2.2.1 骨髓间充质干细胞(BMSC)的培养  25-26
    2.2.2 MTT法检测rBMSC在双层支架上的增殖  26-27
    2.2.3 rBMSC复合双层支架的扫描电镜(SEM)观察  27
    2.2.4 von Kossa法检测rBMSC在双层材料上的骨向分化  27
    2.2.5 实时荧光定量PCR检测hBMSC在支架上的骨向分化基因的表达  27-29
  2.3 实验结果  29-31
    2.3.1 rBMSC和hBMSC的细胞形态  29
    2.3.2 rBMSC在胶原和PLA支架上的粘附  29
    2.3.3 rBMSC在双层支架上的增殖  29-30
    2.3.4 rBMSC在双层支架上的骨诱导分化  30
    2.3.5 hBMSC在双层支架上骨向分化基因表达情况  30-31
  2.4 讨论  31-32
3 第三部分双层支架体内原位修复兔膝关节骨软骨缺损  32-52
  3.1 实验材料  32-33
    3.1.1 材料和试剂  32
    3.1.2 实验仪器及材料  32
    3.1.3 相关溶液配置  32-33
    3.1.4 实验动物  33
  3.2 试验方法  33-37
    3.2.1 关节软骨损伤的模型  33
    3.2.2 观察指标  33-35
    3.2.3 组织学染色(H&E染色和SO染色)  35-36
    3.2.4 关节软骨缺损修复的组织学评分  36
    3.2.5 关节软骨缺损修复的力学测试  36-37
    3.2.6 关节软骨缺损修复的micro-CT扫描  37
    3.2.7 统计学分析  37
  3.3 实验结果  37-47
    3.3.1 关节骨软骨缺损修复的大体肉眼观察及评分  37-38
    3.3.2 关节骨软骨缺损修复的大体评估  38-39
    3.3.3 关节骨软骨缺损术后6周和12周组织学观察和评分  39-43
    3.3.4 关节骨软骨缺损修复的组织学评估  43-46
    3.3.5 关节骨软骨缺损修复的力学测试  46-47
    3.3.6 关节软骨缺损修复的micro-CT检测  47
  3.4 讨论  47-52
4 第四部分结论  52-54
参考文献  54-61
综述  61-76
  参考文献  68-76
作者简历  76

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