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血管内皮生长因子受体在正常表皮和银屑病皮损角质形成细胞中的表达与功能研究

作　者: 满孝勇
导　师: 郑敏
学　校: 浙江大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: 银屑病 表皮角质形成细胞 皮损 血管新生 浙江大学 血管内皮细胞 角质层 基底层 表达水平 蛋白质
分类号: R758.63
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


[研究背景]银屑病是一种由多基因遗传决定的、多环境因素刺激诱导的免疫异常性慢性炎症性增生性皮肤病。其特征包括表皮角质形成细胞增生过度和异常分化、淋巴细胞（绝大多数为T细胞）浸润、真皮血管改变,如血管新生、扩张、迂曲、高内皮小血管形成。血管新生在银屑病的发病中发挥重要的作用。不论在正常的生理条件下还是在病理状态下,血管新生（Angiogenesis）都是重要的生物学过程,主要由生长因子和其相应的酪氨酸激酶受体（RTKs,receptortyrosine kinases）控制,而其中最主要的就是血管内皮生长因子（VEGF,vascularendothelial growth factor）家族及其受体VEGFRs（VEGF receptors,包括VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3和辅助受体Neuropilin（NRP）-1和NRP-2）。目前的研究发现,VEGF家族包括VEGF-A,PlGF（placenta growth factor,胎盘生长因子）,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,VEGF-E和svVEGF（snake venomVEGF,蛇毒VEGF）。VEGF-A,即一般意义上的VEGF,既往称为VPF（vascular permeability factor,血管通透性因子）,存在于多种组织、细胞中,与细胞的生理和病理活动密切相关,如肿瘤的血管新生和血管形成。VEGF在基因转录过程中由于不同的剪接方式形成几种分子量不同的VEGF同种异构体,在人类主要为VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206等。表皮角质形成细胞是VEGF的主要分泌细胞之一,在某些炎症性皮肤病如银屑病、特应性皮炎等情况下,皮肤角质形成细胞分泌VEGF明显增加,通过旁分泌作用促进真皮层微血管增生。角质形成细胞主要分泌VEGF121、VEGF165和VEGF189,其中VEGF165效应性最强。VEGF通过其受体发挥生物学效应,这些受体分为跨膜酪氨酸激酶受体和非酪氨酸激酶受体（辅助受体）,分别包括VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3和neuropilins（NRP-1和NRP-2）。VEGFR-2是介导VEGF促血管新生效应的主要受体。近年来,越来越多的研究发现VEGFR家族不仅表达在血管内皮细胞上,而且在一些非血管内皮细胞上也有表达。越来越多的证据表明,VEGF/VEGFR信号途径已经不再局限于血管新生/血管通透性的增加,而是具有多种功能,包括诱导肿瘤的转移、参与炎症反应、神经保护功能、保护肝脏、参与骨髓干细胞的迁移以及淋巴血管新生等。因此,需要对VEGF/VEGFR进行更深入的研究。[目的]明确VEGF受体在正常人表皮和银屑病非皮损区、邻近皮损区和皮损区角质形成细胞中的表达情况,重点研究VEGF通过VEGFR-2对表皮角质形成细胞增殖、迁移和黏附的作用;VEGFR在银屑病不同发展阶段的可能作用;以及某些调控因素如Ca++和VEGF对银屑病VEGFRs表达的影响。[方法]第一部分:分离、培养正常人表皮角质形成细胞,提取总RNA和蛋白质。以逆转录-聚合酶链反应（Reverse transcript polymerase chain reaction,RT-PCR）检测正常人表皮角质形成细胞VEGFRs和NRPs mRNA的表达水平;以Western-blot法检测表皮角质形成细胞VEGFRs和NRPs蛋白质的表达水平;以间接免疫荧光法对VEGFRs和NRPs在正常表皮的表达进行定位;使用外源性VEGF165作为刺激因子,观察不同浓度VEGF165对表皮角质形成细胞增殖、黏附和迁移能力的变化。另外使用VEGFR-2的中和性抗体预处理表皮角质形成细胞,以进一步了解VEGFR-2在角质形成细胞增殖、迁移和黏附过程中是否发挥重要作用。第二部分:切取银屑病患者非皮损区、邻近皮损区和皮损区的皮肤,分别分离、培养其表皮角质形成细胞,提取总RNA和蛋白质。以RT-PCR和实时定量PCR（qPCR）分别检测银屑病患者非皮损区、邻近皮损区和皮损区的表皮角质形成细胞VEGFRs mRNA的表达水平;以Western-blot法检测这些角质形成细胞VEGFRs蛋白质的表达水平;以间接免疫荧光法对VEGFRs在银屑病不同发展阶段表皮中的表达进行定位;以外源性Ca++刺激银屑病非皮损区表皮角质形成细胞,观察其对VEGF和VEGFRs mRNA和蛋白质表达的影响;以外源性VEGF165刺激银屑病非皮损区表皮角质形成细胞,观察其对VEGFRs表达的作用;同时,以VEGF的特异性中和性抗体Bevacizumab与Ca++共同作用于银屑病非皮损区表皮角质形成细胞,判别Ca++是否通过影响VEGF的表达而影响VEGFRs的表达。[结果]一、VEGFRs和NRPs在正常人表皮中的表达:1.表皮角质形成细胞表达VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3和NRP-1、NRP-2 mRNA;2.表皮角质形成细胞在蛋白水平表达VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3和NRP-1、NRP-2:3.免疫荧光检测结果发现,表皮均有VEGFRs和NRPs的荧光信号。VEGFRs和NRPs在表皮的分布模式不尽相同:VEGFR-1和VEGFR-2荧光信号在表皮基底层和邻近基底层的棘细胞层（暂时扩增细胞）强烈表达,颗粒层和邻近颗粒层的棘细胞层表达较少,角质层没有表达;而VEGFR-3,NRP-1和NRP-2均匀地表达于除角质层以外的其它表皮各层。VEGFRs和NRPs在角质形成细胞内的分布形式亦有所差异:VEGFRs沿着细胞间连接呈膜性分布,而NRPs在细胞膜和细胞浆中均有分布。二、VEGFR-2与表皮角质形成细胞生物学活性:1.VEGF165呈剂量依赖性地促进角质形成细胞的增殖,而VEGFR-2的中和性抗体则部分阻断VEGF165的促增殖效应;2.VEGF165能大幅度促进角质形成细胞的迁移,而抗VEGFR-2抗体预处理能显著抑制VEGF165诱导的角质形成细胞的迁移数量;3.VEGF165降低角质形成细胞的黏附,而VEGF的这一作用则能被VEGFR-2抗体逆转。三、VEGFRs在银屑病中的表达1.在银屑病患者的皮肤中,VEGFR-1和VEGFR-2的荧光信号强烈地标记于银屑病非皮损区和邻近皮损区除角质层以外的其它各层角质形成细胞、银屑病皮损区表皮全层角质形成细胞,包括角质层角化不全的细胞。在银屑病非皮损区、邻近皮损区VEGFR-3的分布与在正常表皮中的分布一致,而银屑病皮损区则在包含角质层角化不全细胞的表皮各层均表达VEGFR-3;2.VEGFR-1,VEGFR-2和VEGFR-3 mRNA表达水平从正常表皮到银屑病非皮损区、邻近皮损区和皮损区逐渐增加,皮损区表皮角质形成细胞VEGFRs mRNA表达水平最高;3.银屑病皮损区角质形成细胞VEGFR-1,VEGFR-2和VEGFR-3蛋白质表达水平较正常表皮、银屑病非皮损区和邻近皮损区表皮角质形成细胞显著增高。四、Ca++和VEGF对银屑病非皮损区角质形成细胞VEGFRs表达的影响1.Ca++呈剂量依赖性地促进VEGF121、VEGF165和VEGF189mRNA和蛋白质的表达,在1.0 mM时这一促进效应达到最高;Ca++对VEGF165蛋白表达的促进作用较对VEGF121和VEGF189的促进效应更为明显;2.Ca++剂量依赖性地上调银屑病非皮损区角质形成细胞VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3 mRNA和蛋白质的表达;3.10ng/ml VEGF165能显著地促进银屑病非皮损区角质形成细胞VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3的表达;4.Bevacizumab在1.0 mg/ml时能中等或大量地降低VEGF诱导的VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3的蛋白合成。但是,将1.0 mM Ca++与1.0 mg/ml Bevacizumab共同加入培养的银屑病角质形成细胞后,VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3的表达仍然增高,与未加1.0 mg/mlBevacizumab而单独应用1.0 mM Ca++刺激的细胞相比,其表达VEGFR-1,VEGFR-2和VEGFR-3的增加量没有明显的差异。[结论]一、体外培养的人表皮角质形成细胞表达VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3和其辅助受体NRP-1、NRP-2的mRNA和蛋白质;二、在正常健康人皮肤中,VEGFRs和NRPs表达于除角质层以外的表皮其它各层,包括基底层、棘层和颗粒层;VEGFR-1和VEGFR-2主要分布于基底层和邻近基底层的棘细胞层,而VEGFR-3和NRP-1、NRP-2较均匀地分布于除角质层外的表皮各层;三、VEGF能促进角质形成细胞的增殖和迁移而抑制角质形成细胞的黏附,VEGF的这些活性部分通过VEGFR-2来完成的。四、银屑病皮损区角质形成细胞表达VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3mRNA和蛋白质较正常表皮角质形成细胞显著增加;五、银屑病皮损区表皮VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3的分布可能与银屑病表皮的增殖、迁移和分化有关;六、VEGF和Ca++可能是促进银屑病皮损VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3表达的因素;七、Ca++促进VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3表达可能独立于VEGF途径。

全文目录


中文摘要  4-9
英文摘要  9-14
研究背景  14-33
  一、VEGF  14-29
  二、主要试剂的配制  29-33
第一部分 血管内皮生长因子受体在正常表皮的表达与功能研究  33-66
  前言  33-35
  材料与方法  35-44
  结果  44-51
  讨论  51-56
  结论  56-57
  参考文献  57-66
第二部分 血管内皮生长因子受体在银屑病皮损表达增高可能受到钙离子和VEGF的调节  66-103
  前言  66-73
  材料与方法  73-82
  结果  82-90
  讨论  90-96
  结论  96-97
  参考文献  97-103
综述  103-121
致谢  121-123
在读期间发表论文  123-125
在读期间参加课题与受到的奖励  125

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中图分类: > 医药、卫生 > 皮肤病学与性病学 > 皮肤病学 > 原因未明的皮肤病 > 牛皮癣（银屑病）
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