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Stat1的热诱导激活及其对hsp90基因调控的机制研究

作　者: 张怡
导　师: 沈珝琲；吴宁华；张业
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 磷酸化位点热激活医科大学启动子活性信号转导途径组蛋白染色质协和热诱导复合物
分类号: Q343
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

Statl(Signal transducers and activators of transcription 1)介导细胞跨膜信号向核内的传入，成为细胞多种信号转导途径相交叉的枢纽，又可直接调控靶基因的转录，广泛参与细胞增殖、分化、细胞周期调控及凋亡过程。通常情况下，Statl以非活化形式存在于胞质中；在外界信号刺激下，Statl可通过Tyr701及Ser727位点的磷酸化而被激活。活化的Statl可以同源或异源二聚体状态在核内与其特异结合元件GAS(interferon Gamma Activated Sequence)相结合而实现其对靶基因的调控作用。参与磷酸化Statl的激酶及其转导途径已有很多报道，但热激诱导的Statl-Tyr701及Ser727磷酸化途径尚未见报道。在细胞热应激过程中最早期的事件是将胁迫信号从细胞表面传至细胞内，从而诱导热休克蛋白的合成使细胞产生对热的耐受性。Hsp90是一类独特的、含量丰富的并对细胞存活必不可少的热休克蛋白家族成员。它参与调节包括基因转录、细胞信号转导、细胞生长、发育、凋亡等许多重要的生理过程。哺乳动物细胞中存在两类主要的Hsp90家族成员即Hsp90α及Hsp90β，两者在蛋白水平上存在很高的同源性，但编码它们的基因却有着完全不同的顺式(cis-)及反式(trans-)调控机制。鉴于Hsp90参与多种激酶的活化，作为热休克蛋白它如何在热激活的信号途径中起作用是一个值得探讨的问题。染色质的修饰及其结构重塑是一个多分子参与的、多途径协同、高度复杂和有序完成的过程。它们也是真核基因在内外环境影响下引发的最重要的核内事件和基因起始转录的前提。本课题组早期研究显示，过表达Statl可降低hsp90α基因的表达。本论文首先研究了热诱导激活的Jak2及PKCε信号转导途径，及其对Statl激活中的作用，发现这一过程需要分子伴侣Hsp90β的参与；进而研究了Statl介导的hsp90α及hsp90β基因热激诱导条件下的表达；并在启动子活性水平较深入地研究了Statl对hsp90α基因热诱导表达的调控机制。1．Jak2及PKCε信号转导途径参与热应激过程中Statl的激活由于Statl-Tyr701及Ser727的磷酸化是Statl活化的标志，我们首先观察了Jurkat细胞42℃热激1小时过程中，两个位点的磷酸化状态。发现热激前Statl就有低水平的磷酸化，在热激过程中磷酸化程度明显升高，表明热激可以诱导Statl的活化。为研究Statl的磷酸化对其功能的影响，构建了Statl-Y／F-S／A突变质粒(Statl-M)。在细胞中过表达Statl-M，经42℃热激1小时及其后在37℃恢复过程中观察细胞周期的变化，发现Statl-M细胞热激前就呈现一定程度的G2／M阻滞，且不能在热激24小时后从G2／M阻滞状态中恢复。这一现象与Hsp90功能抑制剂geldanamycin(GA)引起的阻滞相似，表明活化的Statl不仅为正常细胞周期运转所必需，而且参与细胞从热激引起的阻滞中恢复的过程；同时提示Hsp90可能协助Statl发挥作用。实验证明在热激条件下，GA可能通过抑制Hsp90β功能以分别对Jak2的磷酸化和PKCε转膜活化过程的抑制，从而间接阻断Statl-Tyr701和Ser727位点磷酸化。这一过程显示Hsp90β对Jak2和PKCε途径的热激活起关键作用。我们采用免疫共沉淀技术研究证实了Jak2和PKCε在热激后可分别与Statl相互作用，为此过程参与热激诱导的Statl活化提供了实验证据。2．Statl对热应激过程中hsp90基因表达的调控作用我们采用启动子活性检测技术研究了hsp90α及hsp90β基因的调控机制。实验发现，GA处理、转染显性负突变质粒DN-Jak2以及PKCε-RNAi介导的knockdown细胞中，均显著提高hsp90α启动子的热诱导活性，热激后启动子活性升高5～7倍，对照组仅升高3～4倍；明显抑制hsp90β的启动子活性，抑制率达50～60％。内源性Statl限制了hsp90α热激后的过度表达，热激后hsp90α基因启动子活性仅升高3～4倍；当野生型Statl过表达时，hsp90α基因受热激活效应被抑制50％；当三种磷酸化位点突变体Statl过表达时，失去了对hsp90α基因的限制作用，热激后启动子活性升高6～10倍。野生型Statl可增强hsp90β转录，磷酸化位点突变体可强烈抑制hsp90β基因的热诱导表达。以上结果显示，尽管hsp90α及hsp90β基因都可被热激诱导表达，但二者的调控机制不同，Statl可通过对启动子的顺、反式调控分别决定hsp90α和hsp90β基因的表达。热激诱导的Jak2和PKCε信号途径活化需要Hsp90β的参与，并激活其下游分子Statl；而Statl活化后又可增强hsp90β基因的表达，最终形成了Hsp90β“自身调控”的循环机制。与此相反，Statl可与hsp90α基因启动子的GAS位点结合，进而募集热激决定的其它转录因子以完成对该基因热激诱导的多样性调控作用。本论文研究发现，在热应激条件下，Jak2及PKCε信号转导途径活化需要Hsp90β的参与以完成对Statl-Tyr701和Ser727的磷酸化。活化的Statl入核并结合在靶基因的启动子区，使Statl直接参与靶基因hsp90的调控。

全文目录

缩写词表  4-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-13
前言  13-19
材料与方法  19-42
结果  42-72
讨论  72-79
小结  79-80
附录:人胎脑中hSNF5结合蛋白的筛选、克隆及分析  80-105
文献综述(一)  105-118
文献综述(二)  118-129
参考文献  129-138
致谢  138-140

Stat1的热诱导激活及其对hsp90基因调控的机制研究

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