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人D-酪氨酰-tRNA脱酰基酶（h-DTD）的功能研究

作　者: 郑亘
导　师: 强伯勤；袁建刚；彭小忠
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 研究生论文氨基酸残基蛋白质合成医科大学中枢神经系统氨酰化核孔复合体协和合成酶神经元
分类号: Q55
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

在地球上的三界中的生物，都选择了以L构象的氨基酸作为蛋白质合成的原料，D构象的糖作为核酸合成的原料，D-氨基酸曾经被认为只存在于细菌细胞壁中。随着分析手段的提高，人们发现很多生物体内不仅有D-氨基酸参与蛋白质合成，还存在着大量的游离D-氨基酸。D-氨基酸被发现对很多生物体都具有毒性，在大肠杆菌中D-的氨基酸毒性被发现主要来自于通过氨酰化来占据tRNA（1），造成细胞内能参与正常代谢的L-氨酰化tRNA以及游离tRNA的缺乏，从而抑制蛋白质的合成。三界的生物中都能发现D-酪氨酰-tRNA脱酰酶(D-Tyr-tRNA^Tyr Deacylase,DTD)，能够水解多种被错误D-氨酰化的tRNA，来释放tRNA以对D-氨基酸去毒（1-3）。在人体内，存在着高浓度的D-氨基酸，并且这些D-氨基酸具备着重要的生理功能。在中枢神经系统中存在着高浓度的D-丝氨酸和D-天冬氨酸。D-丝氨酸作为神经系统中起着多种重要功能的谷氨酸受体NMDA受体的生理配基，起着非常重要的作用。而D-天冬氨酸不仅在神经系统总可以起到神经递质／神经调制的作用，在内分泌系统中还能够起着调节激素合成释放的作用（4）。D-天冬氨酸和D-丝氨酸在Aβ肽中的沉积引起的肽折叠错误一直被认为是阿尔森海默氏病（alzheimer’s disease,AD）的重要病因。所以控制tRNA的质量，尤其是保证tRNA正确的氨基酸手相偏好性对于保证遗传信息的忠实传递，维持人体尤其是中枢神经系统的正常功能有着重要的作用。我们的研究表明人D-酪氨酰-tRNA脱酰基酶（h-DTD）主要分布于中枢神经系统的大神经元中，与D-氨基酸在脑中的分布有着很高的一致性。免疫组化和免疫荧光实验都表明h-DTD主要定位于核周，能够和核孔复合体（nuclear pore complex, NPC）标记物共定位。分段定位表明，与DNA结合有关的C端结构域不影响h-DTD的核周定位。使用抗血清来对HeLA细胞内源性h-DTD进行免疫荧光染色，我们发现处于不同细胞周期中的细胞中，有的h-DTD主要定位于核周而有的在核中也有分布。在M期的细胞中，h-DTD和NPCmarker一样显示出纺锤体样分布。免疫电镜实验表明定h-DTD主要位于HeLa细胞核孔处，在核内以及核仁生发中心也有胶体金颗粒分布。高浓度D-Tyr的处理能够引起tRNA^Tyr的核聚集，并使的tRNA^Tyr氨酰化水平不升反降。h-DTD沉默和D-Tyr的处理都能够使tRNA^Tyr表达水平下降。h-DTD沉默会加重D-Tyr对蛋白质合成的抑制。过表达h-DTD能减弱D-Tyr D-Asp和D-Ser的对HeLa细胞的毒性，而h-DTD沉默则会加重其毒性。h-DTD沉默和D-Tyr的处理都使G1期的细胞总量减少，S和G2／M期的细胞总量增高。这些结果说明核孔处的h-DTD很可能起着过滤D-氨酰化的tRNA的作用，通过水解来防止D-氨酰化的tRNA出核来控制tRNA的质量，在细胞中担负着D-氨基酸去毒的任务。作为一个单独的能作用于多种D-氨酰化tRNA的编辑分子，h-DTD能够高效地在氨酰化这一步防止D-氨基酸参与蛋白质合成，从而阻止D-氨基酸残基在蛋白质中沉积，在抗神经退行性病变的机制中h-DTD很有可能起着重要的作用。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
前言  8-10
实验材料  10-15
实验方法  15-30
实验结果  30-46
讨论  46-57
小结  57-58
参考文献  58-60
综述一种神经保护性肽Humanin的研究进展  60-69
致谢  69-71

人D-酪氨酰-tRNA脱酰基酶（h-DTD）的功能研究

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