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红茶菌优势微生物的分离、鉴定及抗菌机理的研究

作　者: 蒋立文
导　师: 刘德华
学　校: 湖南农业大学
专　业: 茶学
关键词: 红茶菌 醋酸菌 酵母菌 乳酸菌 抗菌蛋白质 儿茶素
分类号: TS272
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


红茶菌发酵液是一种由酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等多种微生物发酵而成的一种传统酸性茶饮料。其发酵液中含有多种营养因子,包括茶叶中一些营养成分、活的微生物细胞及其代谢产物。红茶菌来源不同,微生物种类差异很大。本论文对红茶菌优势微生物的分离鉴定、抗菌微生物的筛选、发酵液中蛋白质分析条件优化,培养过程中菌相及发酵液中的物质变化及其抑菌机理进行了研究。主要研究结果如下:1从红茶菌中分离了3类共12株微生物从红茶菌中分离和鉴定的微生物有:6株醋酸菌包括2株液化醋杆菌(A.liquefaciens),1株醋化醋杆菌(A.aceti),2株重氮营养醋杆菌(A.diazot-rophicus),1株甲醇醋杆菌(A.metha nolica),4株酵母菌包括克鲁丝假丝酵母(Candida Krusei),汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii),栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces prombe Linder),酿酒酵母(Saccharomyces cerivisiae),乳酸菌LA(Lactobacillus A)及乳酸菌LP(Lactobacillus P)。其中重氮营养醋杆菌(A.diazot-rophicus)、甲醇醋杆菌(A.metha nolica)为首次发现。2培养过程中菌相处于动态变化中在培养过程中发现,红茶菌发酵液每毫升的微生物数量比每克菌膜中多。培养至第6d,发酵液中的醋酸菌的数量比菌膜中的数量高出7倍;酵母菌的数量高2倍。在培养过程中醋酸菌和酵母菌的生长曲线相似。发酵液中的乳酸菌数量比酵母菌和醋酸菌低,其对数生长期在培养后的第6d～8d,比醋酸菌、酵母菌慢得多。培养时间长短不同,菌的数量存在差异。从红茶菌中分离出的醋酸菌和酵母菌分别培养,发酵液中的数量变化具有典型的微生物生长曲线,但醋酸菌和酵母菌混合培养,二者的发酵液中的数量变化趋势无显著差异,但其发酵液中的微生物数量高于红茶菌菌膜培养的数量,pH值高于红茶菌发酵液。3红茶菌成膜及发酵液中的物质变化红茶菌培养成膜与糖代谢密切相关。培养液糖含量是影响成膜的主要因素,添加适当浓度酒精、酵母膏和蛋白胨能明显提高菌膜的生成量;培养液的表面积增大,有利于膜的形成;仅以酒精作为碳源不成膜。培养液pH高低与膜生成量呈负相关。红茶菌培养过程中,发酵液中的可溶性固形物含量变化基本呈直线下降趋势,pH值在发酵前期急剧下降,中后期保持稳定。培养12d,发酵液中游离氨基酸总量从培养液的70.494μg/mL降到27.439μg/mL。酵母菌Y3、醋酸菌C64和乳酸菌LA和LP混合培养,形成了培养液没有的氨基酸。在酵母菌Y3、醋酸菌C64、乳酸菌LA、LP、红茶菌分别培养及Y3、C64、LA、LP混合培养中,其发酸液中儿茶素的总量下降。但在酵母菌Y3、醋酸菌C64分别培养中,发酵液中的EGC、EC含量大幅度增加,其他儿茶素含量都下降,而ECG降至培养液的20%以下。在乳酸菌LA、LP分别培养中,发酵液中的EGC、EC含量大幅度减少,DL-C、GCG含量大幅度增加。红茶菌及酵母菌Y3、醋酸菌C64和乳酸菌LA和LP混合培养中,而DL-C、EC含量增加。结果表明,酵母菌、醋酸菌具有降解酯型儿茶素的作用,乳酸菌有改变儿茶素空间结构的作用。4抗菌优势微生物的筛选除去乙酸的醋酸菌发酵液,有促进指示菌生长的作用,选择出了促进作用较弱的C64菌株。酵母菌、乳酸菌均具有一定的抑制指示菌的能力,醋酸菌C64和Y3混合培养抑菌效果最强,选择出了具有较强抑菌能力的酵母菌Y3和乳酸菌LA和LP。因此,确定了抗菌能力强的优势微生物粟酒裂殖酵母Y3、醋酸菌C64、乳酸菌LA和乳酸菌LP组合。5发酵液蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳条件优化对红茶菌发酵液蛋白质的分析方法进行了研究。结果表明,调节发酵液pH至6.0,加入0.2%不溶性PVP,振荡20min,4000r/min离心15min,MD34透析袋透析3d,冷冻浓缩获得的蛋白质电泳样品液;11%分离胶,5%浓缩胶电泳,能获得清晰的蛋白质谱带。6发酵液抗菌是酸性物质、抗菌蛋白、茶多酚等协同作用的结果采用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌作为指示菌,分别对不同浓度的茶叶水浸出物,红茶菌发酵液的pH值,发酵液的透析液,透析液分别经胰蛋白酶、过氧化氢酶、蛋白酶K处理的样品液的抑菌效果进行了研究。1.0%(W/V)茶叶的水浸出物、红茶菌发酵液及发酵液的透析液对指示菌均有抑菌效果,经胰蛋白酶、蛋白酶K处理的样品液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑制效果明显降低,说明红茶菌发酵液中存在抑菌蛋白。红茶菌发酵液的抗菌作用是由酸性物质、抗菌蛋白、茶多酚协同作用的结果。

全文目录


摘要  4-7
Abstract  7-17
第一章 绪论  17-29
  1 茶叶发酵中的主要微生物及红茶菌中优势微生物分离纯化  18-20
  2 红茶菌的发酵机理及代谢产物分析的研究  20-22
  3 红茶菌发酵液中抗生活性成分的研究  22-24
  4 红茶菌发酵液中抗菌蛋白质的分离方法研究现状  24-25
  5 红茶菌发酵液对人体安全性的研究  25-26
  6 红茶菌发酵饮料的研究现状及存在的问题  26-28
    6.1 红茶菌发酵工艺研究  26-27
    6.2 值得注意的问题  27-28
  7 本论文研究的主要内容  28-29
第二章 红茶菌中优势菌种的分离与鉴定  29-45
  引言  29
  1 材料与方法  29-38
    1.1 材料  29-31
    1.2 主要仪器设备  31
    1.3 主要药品与试剂  31
    1.4 菌种的分离与纯化方法  31-32
    1.5 菌种的鉴定方法  32-38
  2 结果与分析  38-43
    2.1 醋酸菌的分离鉴定结果  38-39
    2.2 酵母菌的分离鉴定结果  39-42
    2.3 乳酸菌的分离鉴定结果  42-43
  3 结论与讨论  43-45
第三章 红茶菌培养过程中菌相变化的研究  45-59
  引言  45
  1 材料与方法  45-49
    1.1 材料  45-46
    1.2 主要仪器设备  46
    1.3 主要药品与试剂  46-47
    1.4 方法  47-49
  2 结果与分析  49-57
  3 结论与讨论  57-59
第四章 红茶菌培养过程中成膜的研究  59-67
  引言  59
  1 材料与方法  59-62
    1.1 材料  59
    1.2 培养基及扩大培养  59-61
    1.3 方法  61-62
  2 结果与分析  62-65
    2.1 不同菌种及其组合对成膜的影响  62-63
    2.2 培养液成分、PH值对成膜的影响  63-65
  3 结论与讨论  65-67
第五章 红茶菌培养过程中物质变化的研究  67-81
  前言  67
  1 材料与方法  67-69
    1.1 材料  67-68
    1.2 培养基  68-69
    1.3 方法  69
  2 结果与分析  69-78
    2.1 红茶菌培养过程中主要物质的变化  69-71
    2.2 优势菌种培养过程中的物质变化  71-78
  3 结论与讨论  78-81
第六章 产生抗菌物质的优势微生物筛选  81-87
  引言  81
  1 材料与方法  81-83
    1.1 菌种  81
    1.2 培养基  81
    1.3 供试菌液的制备  81-82
    1.4 菌种的扩大培养  82
    1.5 不同菌种及其组合培养  82-83
    1.6 抑菌效果的检验  83
    1.7 多菌种组合培养液的评价  83
  2 结果与讨论  83-85
    2.1 不同醋酸菌生长及其发酵液抑菌效果的差异  83-84
    2.2 不同酵母菌生长及其培养液抑菌效果的差异  84
    2.3 不同乳酸菌生长及其发酵液抑菌效果的差异  84
    2.4 各菌种共培养液的抑菌效果  84-85
    2.5 各菌种共培养发酵液的评价  85
  3 结论与讨论  85-87
第七章 红茶菌发酵液蛋白质分析方法的研究  87-98
  1 引言  87
  2 材料和方法  87-91
    2.1 菌种及其培养  87-89
    2.2 主要仪器试剂  89-90
    2.3 电泳流程及条件  90
    2.4 样品及其前处理  90-91
    2.5 染色条件的确定  91
  3 结果与分析  91-96
  4 结论与讨论  96-98
第八章 红茶菌培养液抑菌机理的研究  98-110
  引言  98-99
  1 材料与方法  99-102
    1.1 材料  99
    1.2 菌种培养及其培养条件  99-100
    1.3 培养基  100-101
    1.4 抑菌效果的检测  101
    1.5 红茶菌培养液中的蛋白质分析与抑菌蛋白质的确认  101-102
  2 结果与分析  102-108
    2.1 茶汁浓度对抑菌的影响  102-103
    2.2 样品液E、F的抑菌效果  103
    2.3 样品液A、B的抑菌效果  103-104
    2.4 样品液C、D的抑菌效果  104-105
    2.5 红茶菌及其优势菌组合在培养过程中的蛋白质组成变化  105-106
    2.6 抑菌蛋白质的确定  106-108
  3 结论与讨论  108-110
第九章 结论、讨论、创新点及今后研究方向  110-113
  1 结论  110-111
  2 讨论  111-112
  3 主要创新点  112
  4 今后研究的方向  112-113
参考文献  113-121
附录  121-134
致谢  134-135
作者简介  135-136

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 饮料冷食制造工业 > 茶
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