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雌激素对大鼠咀嚼肌功能状态影响的体外研究

作　者: 王喜军
导　师: 易新竹
学　校: 四川大学
专　业: 口腔基础医学
关键词: 颞下颌关节紊乱病雌激素咀嚼肌
分类号: R782.6
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

颞下颌关节紊乱病（temporomandibular disorders,TMD）是口腔常见病，病因复杂，涉及到咀嚼肌、颞下颌关节以及各相关结构。TMD的发病率女性高于男性，其严重程度与年龄有关。TMD多开始于青春期，在生育年龄达到高峰。女性高发病率以及年龄分布特点提示雌激素可能与TMD的发生发展存在相关性。雌激素的生物学效应是通过受体（estrogen receptors,ER）介导的。研究表明颞下颌关节髁突、软骨、关节盘、关节囊中存在ER，因此雌激素可能对颞下颌关节组织结构的发育、改建重建及代谢产生影响。但是雌激素对于咀嚼肌功能状态的作用还不十分清楚。咀嚼肌的功能与颞下颌关节的功能活动及TMD的发病息息相关。咀嚼肌功能紊乱得不到及时治疗，肌的紊乱可导致关节内压增加和关节结构间的摩擦，损伤关节组织，可能发展为结构紊乱疾病及骨关节病，导致或加重关节损害。而如果及时阻断病因循环中的肌功能紊乱环节，有可能减轻或阻止其它类型颞下颌关节紊乱病的发展。本研究的目的就在于通过建立咀嚼肌成肌细胞的体外培养模型，研究成肌细胞中ER的表达以及不同浓度17β—雌二醇对咀嚼肌成肌细胞增殖、肌球蛋白重链mRNA转录和细胞内钙离子的影响，试图揭示雌激素对咀嚼肌特性和功能状态的影响，从而探讨雌激素在TMD咀嚼肌紊乱病中的作用。为建立大鼠咀嚼肌成肌细胞体外培养模型，以机械分离加酶消化法从5-7天SD大鼠颌面部获取成肌细胞，以差速贴壁法纯化细胞，观察细胞形态，建立生长曲线，以免疫细胞化学染色方法鉴定获得的细胞。结果表明培养的成肌细胞结蛋白（Desmin）染色阳性，阳性染色细胞数大于95％，表明获得的成肌细胞纯度较高。所以本实验所建立的大鼠咀嚼肌成肌细胞体外培养模型可以用于后续的实验。为观察成肌细胞中ER的表达，在细胞培养液中加入不同浓度的17-β雌二醇，以免疫细胞化学染色方法检测ER的表达。结果表明，ERα和ERβ在成肌细胞中都有表达，ERα的表达强于ERβ，ERα主要表达于细胞核，而ERβ主要表达于细胞浆。雌激素能上调ERα和ERβ的表达，在10^-10～10^-8mol/L浓度范围内呈剂量依赖性。因此，咀嚼肌成肌细胞能够表达功能性雌激素受体，受体的表达受雌激素的调节；咀嚼肌可能是雌激素的靶组织。为研究雌激素对咀嚼肌成肌细胞增殖的作用，在细胞培养液中加入不同浓度的17-β雌二醇，以³H-TdR法检测细胞增殖情况。结果显示，除了在10^-8mol/L时有一波动外，17-β雌二醇随着浓度的增加都能降低成肌细胞³H-TdR的掺入率，呈剂量依赖性，在10^-6mol/L时作用最明显。成肌细胞的增殖对于咀嚼肌的生长发育、修复重建有重要作用。因此，雌激素可能抑制咀嚼肌成肌细胞的增殖，从而影响咀嚼肌的功能。为研究雌激素对咀嚼肌成肌细胞肌球蛋白重链亚型mRNA表达的影响，在细胞培养液中加入不同浓度的17-β雌二醇，以荧光定量RT-PCR的方法检测mRNA的表达。结果显示雌激素能明显上调MHCⅠmRNA的表达，对MHCⅡb mRNA的表达有明显下调作用。雌激素对MHCⅡa和Ⅱx的作用不明显。MHC亚型表达的不同决定着肌肉不同的收缩特性。因此雌激素能调节咀嚼肌成肌细胞MHC亚型mRNA的表达，从而可能影响咀嚼肌的功能特性。为研究雌激素对咀嚼肌成肌细胞胞浆钙离子的影响，以酸刺激模拟咀嚼肌疲劳状态，以Fluo-4-AM对细胞内钙离子染色，通过激光共聚焦显微镜动态观察一段时间内静息状态下以及酸性刺激下雌激素对咀嚼肌细胞胞浆Ca²⁺浓度的影响。结果显示，静息状态下，加入10^-9mol/L、10^-8mol/L和10^-7mol/L的17β-雌二醇后使细胞内钙离子浓度迅速升高，随即迅速下降并在与静息状态胞浆钙离子浓度相当的水平上重新形成动态平衡；酸刺激时，加入10^-9mol/L、10^-8mol/L和10^-7mol/L的17β-雌二醇后使细胞内钙离子浓度迅速降低，并在比原来低的水平上形成新的动态平衡。胞浆钙离子对维持细胞正常功能有重要作用，钙离子蓄积是骨骼肌疲劳及损伤的关键事件。因此，一定浓度的雌激素能够使酸刺激下的咀嚼肌成肌细胞钙离子浓度维持在较低的水平，从而减少胞浆钙离子超载，维持咀嚼肌正常的功能。总之，本研究成功培养了大鼠咀嚼肌成肌细胞，可以作为体外培养模型进行相关研究。咀嚼肌成肌细胞中有雌激素受体的表达，咀嚼肌是雌激素的靶组织。雌激素能够抑制成肌细胞的增殖，调节肌球蛋白重链亚型mRNA的表达，改变咀嚼肌的特性，并能减少酸刺激下成肌细胞胞浆钙离子的蓄积。从结果看，雌激素对咀嚼肌的作用是复杂的、非线性的，可能通过影响肌肉的生长发育、改建重建以及收缩特性和功能状态在咀嚼肌紊乱的发生发展过程中起作用。

全文目录

缩略词表  5-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-15
前言  15-17
第一部分咀嚼肌成肌细胞体外培养与鉴定  17-29
  材料与方法  17-22
  结果  22-24
  讨论  24-28
  小结  28-29
第二部分雌激素对雌激素受体表达的调节研究  29-38
  材料与方法  29-32
  结果  32-34
  讨论  34-37
  小结  37-38
第三部分雌激素对咀嚼肌成肌细胞增殖的影响  38-44
  材料与方法  38-40
  结果  40-41
  讨论  41-43
  小结  43-44
第四部分雌激素对咀嚼肌肌球蛋白重链mRNA表达的影响  44-64
  材料与方法  44-53
  结果  53-60
  讨论  60-62
  小结  62-64
第五部分雌激素对咀嚼肌成肌细胞内钙离子的影响  64-72
  材料与方法  64-66
  结果  66-68
  讨论  68-71
  小结  71-72
全文总结  72-73
参考文献  73-82
综述  82-103
个人简历  103-104
致谢  104

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