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丹参酮ⅡA诱导急性早幼粒细胞性白血病分化机制的研究

作　者: 伍学强
导　师: 羊裔明
学　校: 四川大学
专　业: 内科血液学
关键词: 急性早幼粒细胞性白血病 丹参酮IIA 全反式维甲酸 三氧化二砷 PML/RARα融合基因 PML-RARα融合蛋白 C/EBPβ蛋白
分类号: R733.71
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


1．目的通过对丹参酮（Tanshinone，TanⅡA）与全反式维甲酸（ATRA）及三氧化二砷（As2O3）诱导急性早幼粒细胞性白血病（APL）细胞分化在细胞学、免疫表型和分子生物学水平的比较，探讨TanⅡA诱导APL细胞分化的分子机制，为临床应用TanⅡA治疗APL奠定理论基础。2．方法2．1细胞培养10％小牛血清RPMI1640培养NB4细胞，分别取对数生长期的NB4细胞4×105个，分别加入不同浓度的三种药物，设7组，分别是浓度为1.70、2.55、3.40μmol／L（0.5、0.75、1.0μg／ml）的三个TanⅡA组、浓度为0.1μmol／L As2O3组、1μmol／L As2O3组、1.0μmol／L ATRA组和浓度为0.01％DMSO对照组。分别观察、检测培养12h、24h、48h、72h、86h、120h、144h、168h等不同时间点细胞的各项指标。2．2 NB4细胞生长曲线的测定取各组各时间段NB4细胞，用台盼兰拒染法在光镜下计数细胞，以时间为横坐标，活细胞为纵坐标，绘制生长曲线。2．3 NB4细胞分化形态学观察及分化抗原的检测取各组各时间段NB4细胞，PBS洗涤后，加小牛血清涂片，姬木萨—瑞氏染色后细胞形态观察；同时将细胞用PBS洗两遍，调整细胞浓度至1×106／mL。取100μl细胞悬液，分别加入鼠抗人的PE标记的CD11b、和FITC标记的CD33的抗体10μl，室温放置10min，用流式细胞仪进行细胞分化抗原(CD33、CD11b)表达检测。2．4 NB4细胞PML／RARα融合基因mRNA的检测取各组各时间段NB4细胞，用trezol法提取NB4细胞tRNA，用实时定量PCR方法检测NB4细胞中PML／RARαmRNA。2．5 NB4细胞PML-RARα融合蛋白表达水平的检测取各组部分时间段NB4细胞，同时以正常粒细胞作为对照组，采用western blotting检测PML-RARα融合蛋白。2．6 NB4细胞内PML蛋白观察取各组部分时间段NB4细胞，同时以正常粒细胞作为对照组，将NB4细胞离心涂片，按操作规程进行固定、Triton 100打孔、抗PML抗体（PG-M3）、FITC标记的二抗的等处理后，在荧光显微镜下观察并采图。观察PML荧光颗粒的数量、形态和大小并相对量化核小体恢复情况。2．7分化相关蛋白C／EBPβ的检测取各组部分时间段NB4细胞，裂解核蛋白并通过Bio-Rad测定，定量后核蛋白加入Laemmli缓冲液煮沸，在10％的SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳，转移至硝酸纤维膜，加一抗抗C／EBPβ抗体（鼠抗人），孵育后加辣根过氧化酶标记的二抗（羊抗鼠），用增强化学发光法检测，GAPDH做内对照，计算灰度值，对C／EBPβ蛋白进行半定量测定。3．结果3．1 TanⅡA对NB4细胞生长抑制NB4细胞生长受抑程度随着TanⅡA浓度的增加而增加，早期低浓度的TanⅡA（1.70μmol／L）与中高浓度的TanⅡA生长抑制率尚无明显差异，48h后生长抑制率出现显著性差异（p＜0.05）。2.55μmol／L和3.40μmol／L两种浓度组浓度几乎在各时间点均无显著性差异（p＞0.05），2.55μmol／L为TanⅡA抑制NB4细胞的最佳作用浓度。同时TanⅡA对NB4细胞生长抑制作用呈时间依赖性，其最佳作用时间为120h。作用开始48h 2.55μmol／L TanⅡA组与0.10μmol／L As2O3组相比，生长抑制率无显著性差异（p＞0.05），48h以后强于后者，两组的生长抑制率出现显著性差异（p＜0.05）。2.55μmol／L TanⅡA组与1.0μmol／L As2O3组生长抑制率无显著性（p＞0.05）。144h之前2.55μmol／L TanⅡA组明显弱于ATRA组（p＜0.05），至168h两组生长抑制率相当。3．2 TanⅡA诱导NB4细胞分化的形态学变化三种不同浓度的TanⅡA作用于NB4细胞24h时，即可见分化迹象。随着时间的延长，分化迹象逐渐明显，杆状核和分叶核细胞逐渐增多。72h前，三种不同浓度的TanⅡA分化程度之间无显著性差异（p＞0.05）。72h时，1.70μmol／L TanⅡA与其它两组存在显著性差异（p＜0.05）。96h-168h 1.70μmol／L TanⅡA组与其它两组杆状分叶核表达率有显著性差异（p＜0.05）。2.55μmol／L TanⅡA和3.40μmol／L TanⅡA诱导NB4细胞分化程度上各时段无显著性差异（p＞0.05），2.55μmol／L TanⅡA被认为是诱导NB4细胞分化的最佳浓度。TanⅡA诱导NB4细胞分化呈时间依赖性，分化随作用时间增加而增加。2.55μmol／L TanⅡA组和3.40μmol／L TanⅡA组两组细胞诱导分化率和杆状分叶核表达率最佳作用时间为120h。24h时，各组均可见分化迹象，2.55μmol／L TanⅡA组诱导分化作用强于0.1μmol／L As2O3组（p＜0.05），与1.0μmol／L As2O3组相当（p＞0.05），稍弱于1.0μmol／L ATRA组（p＜0.05）。48h—168h期间，2.55μmol／L TanⅡA组诱导分化率强于两组As2O3组（p＜0.05），48h—96h弱于1.0μmol／L ATRA组（p＜0.05）。120h—168h期间，与1.0μmol／L ATRA组相当（p＞0.05）。3．3 TanⅡA诱导NB4细胞分化抗原表达作用24h后，三种不同浓度的TanⅡA诱导NB4细胞CD11b表达逐渐增加，而CD33表达逐渐下降，较低浓度作用差于较高浓度组（p＜0.05）；作用120h后，三组TanⅡA诱导CD11b上调和CD33下调达平台期；较高浓度组各时点分化抗原表达率无差异；2.55μmol／L TanⅡA组为最佳作用浓度，其最佳作用时间为120h。2．55μmol／L TanⅡA上调NB4细胞表达CD11b和下调CD33表达的能力强于0.10μmol／L As2O3组（p＜0.05）和1.0μmol／LAs2O3组（p＜0.05），96h前其能力弱于1.00μmol／L ATRA组（p＜0.05）；96h后与1.00μmol／L ATRA组相当（p＞0.05）。3．4 TanⅡA诱导NB4细胞分化过程中核体变化三种不同浓度TanⅡA处理24h起，细胞核内颗粒均见不同程度的由量多细小细胞颗粒，逐渐变为颗粒粗大、颗粒数量较少的粗颗粒；48h大多数细胞核内为大、小荧光颗粒混杂。至72h核内颗粒呈大的点状或斑点状，颗粒数量在15—30之间，与正常粒细胞对照组相似，TanⅡA作用最佳浓度是2.55μmol／L TanⅡA组；最佳作用时间是72h。在各时间段，三种不同浓度的TanⅡA和其它所有药物组PML荧光颗粒积分与0.01％DMSO组均有显著性差异（p＜0.05）；2.55μmol／L TanⅡA的作用在48h之前较ATRA和As2O3弱（p＜0.05），到72h时作用相当（p＞0.05）。3．5 TanⅡA对NB4细胞PML／RARαmRNA的影响实时荧光定量PCR检测融合基因PML／RARa mRNA，显示三组不同浓度TanⅡA样本Ct值各时间段在25.67±0.3—29.01±0.6之间，三组各时间段样本Ct值和浓度比率无明显差异（p＞0.05）。两组As2O3样本Ct值各时间段在25.45±0.9—28.24±0.6之间，ATRA组样本Cp值各时间段Ct值在26.57±0.8—28.72±0.4之间，各组各时间段样本Ct值和浓度比率无明显差异（p＞0.05）3．6 TanⅡA对NB4细胞PML-RARα融合蛋白的影响三种不同浓度TanⅡA处理NB4细胞12h时，PML-RARa融合蛋白有减少迹象，可见PML条带的出现。三组PML的表达随浓度增加而增加。ATRA组和两种不同浓度的As2O3组，在24h时间点检测中均可见PML-RARa融合蛋白的减少，PML增加的迹象。3．7 TanⅡA对NB4细胞内分化相关蛋白C／EBPβ的影响NB4细胞培养12h时，TanⅡA三种浓度组均可见C／EBPβLAP蛋白表达增加迹象，以1.0μg／ml TanⅡA组明显，同时可见两种C／EBPβLIP异构体（21KDa、8.5KDa）存在。在ATRA组和As2O3组，24h亦可见C／EBPβLAP蛋白增加迹象，但无两种C／EBPβLIP异构体存在。4结论4．1 TanⅡA可诱导NB4细胞向成熟方向分化，分化作用随剂量和作用时间增加而增加，以2.55μmol／L TanⅡA为最佳浓度，以120h为最佳作用时间。TanⅡA诱导NB4细胞分化的能力在初期稍弱于ATRA，120h后与ATRA相当；TanⅡA诱导NB4细胞分化的能力强于As2O3。4．2 TanⅡA能使NB4细胞PML蛋白异常分布重新定位，核小体结构恢复，这种作用亦随TanⅡA浓度和作用时间增加而增加。在早期TanⅡA作用慢于ATRA和As2O3，作用72h后其作用与ATRA和As2O3相当。4．3 TanⅡA能使NB4细胞PML-RARα融合蛋白降解，可使PML得以重新表达。4．4在短期作用时间内（1—7天）TanⅡA不影响PML／RARα融合基因表达。4．5 TanⅡA诱导NB4细胞分化早期，调节NB4细胞内C／EBPβLAP和LIP的表达；ATRA和As2O3也可诱导NB4细胞内C／EBPβ表达，但无C／EBPβLIP表达。

全文目录


中文摘要  6-12
英文摘要  12-20
前言  20-28
第一部分 丹参酮ⅡA、维甲酸及三氧化二砷诱导NB_4细胞分化的形态学及分化抗原表达的比较  28-46
  引言  28-29
  材料及方法  29-32
  结果  32-41
  讨论  41-45
  结论  45-46
第二部分 丹参酮ⅡA诱导NB_4细胞分化过程中对PML-RARa融合基因mRNA及PML-RARa融合蛋白的影响  46-77
  引言  46-48
  材料及方法  48-60
  结果  60-71
  讨论  71-75
  结论  75-77
第三部分 丹参酮ⅡA、维甲酸及三氧化二砷对NB_4细胞C/EBP β分化蛋白的影响  77-89
  引言  77-79
  材料与方法  79-82
  结果  82-84
  讨论  84-88
  结论  88-89
参考文献  89-96
综述 转录因子C/EBPs家族对髓系细胞分化及其在AML发病中的作用  96-122
  正文  96-114
  参考文献  114-122
致谢  122

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病 > 急性白血病
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