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全反式维甲酸诱导大鼠产生肛门直肠畸形的SHh的研究

作 者: 颜禄斌
导 师: 沈阳
学 校: 兰州大学
专 业: 外科学
关键词: 全反式维甲酸 肛门直肠畸形 基因表达 SHh 大鼠
分类号: R726.5
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要


目的1探讨SHh基因在正常和全反式维甲酸致畸的先天性肛门直肠畸形(CAMCongenital anorectal malformation)大鼠胚胎肛门直肠发育过程中的表达情况,旨在探讨SHh基因在先天性肛门直肠畸形发生机制中的作用;2明确CAM发生的分子遗传学机制和胚胎发育规律,为从根本上预防畸形的发生,或在胚胎早期通过基因治疗来修复畸形引起的组织和器官发育缺陷提供线索。方法实验动物取成熟未孕的Wistar大鼠,体重250~300 g,雌雄比例4:1于午夜后合笼,晨8时阴道涂片,显微镜下见到精子或阴道栓计为妊娠0天。实验分组已孕雌鼠随机分为2组,实验组17只及对照组11只。其中实验组在妊娠10天时按135mg/kg体重用量,将全反式维甲酸按40mg/ml与橄榄油形成混悬液后经胃管一次注入;对照组则在妊娠10天时仅给予同样体积的橄榄油。对照组及实验组所有雌鼠在干预后均未见明显的腹泻症状,仅最初2天内有轻微的体重下降或体重不增现象。操作方法实验组及对照组均在妊娠12天、13天、14天、15天、16天、18天、20天时雌鼠在无菌条件下剖宫取仔,所得大鼠胚胎标本经4%多聚甲醛固定、脱水后制成蜡块,行矢状面连续切片,并连续动态观察胎龄12-20天正常及肛门直肠畸形大鼠胚胎肛门直肠的形态学变化过程。选正中矢状面石蜡切片进行SHh免疫组织化学染色,连续动态对比观察SHh在正常和肛门直肠畸形大鼠胚胎肛门直肠发育过程中的表达情况。结果1、动物模型的统计结果在全反式维甲酸诱导的致畸组中,共产胎仔137只,活胎数129只,其中实验后期(16-20天)共获胎仔76只,其中活胎数71只,死胎数5只,外观正常者9.2%(7/76),肛门直肠畸形发生率90.8%(69/76),显性脊柱裂57.8%(44/76),无尾畸形65.8%(50/76),环尾或短尾19.7%(15/76),足畸形47.3%(36/76),脑膜膨出5.2%(4/76),脐膨出2.6%(2/76),而对照组获得92只胎鼠,均未见上述畸形。2、连续石蜡切片观察形态学变化过程:在正常大鼠胚胎发育过程中,自12天至14天观察到尿直肠隔进行性下降,与泄殖腔膜之间的距离越来越小,直至15天,尿直肠隔与泄殖腔膜融合,使腹侧的尿生殖窦与背侧的后肠完全分离。16天,肛膜破裂,直肠与外界相通。而在肛门直肠畸形大鼠胚胎发育过程中,与同龄正常大鼠胚胎相比,尿直肠隔发育较差,泄殖腔膜发育障碍,15天未观察到二者融合,16-20天观察到直肠尿道瘘/泄殖腔畸形的存在。3、SHh免疫组织化学染色结果:SHh表达的部位:正常鼠胚中,SHh阳性区域主要分布于尿直肠隔的间质以及后肠、泄殖腔膜和尿生殖窦的上皮层。肛门直肠畸形组的大鼠胚胎,阳性区域主要集中于尿生殖窦上皮层。SHh表达的水平:在两组大鼠胚胎中,SHh平均光密度值随着胎龄的增长呈总体增加的趋势,在胎龄16天的胎鼠表现最为明显。与对照组比较,肛门直肠畸形组大鼠胚胎尿直肠隔间质、后肠上皮层、泄殖腔膜或肛管上皮/瘘管上皮层平均光密度值明显减小,有统计学意义(P<0.05)。SHh在肛门直肠畸形组各胎龄大鼠胚胎尿生殖窦上皮平均光密度值较对照组无明显差异。结论全反式维甲酸是一种良好的诱导肛门直肠畸形动物模型的致畸剂。肛门直肠畸形的发生与泄殖腔构型异常以及尿直肠隔未与泄殖腔膜融合等因素有关。尿直肠隔未与泄殖腔膜融合是全反式维甲酸诱导的大鼠肛门直肠畸形发生的直接原因。在肛门直肠畸形大鼠胚胎中,在肛门直肠形成的关键时期(13~16天),SHh存在着时空表达不平衡的特点;在正常大鼠胚胎期泄殖腔和直肠发育过程中,SHh可能起重要作用。泄殖腔/后肠SHh的表达下调可能与肛门直肠畸形的发生有关。

全文目录


论文摘要(中文)  5-7
Abstracts  7-9
研究背景和立题依据  9-16
  1、先天性肛门直肠畸形的胚胎学研究进展  11-12
  2、SHh信号通路的构成、途径及其调控  12-14
  3、SHh信号转导与先天性肛门直肠畸形  14-16
材料与方法  16-20
  1.实验材料  16
    1.1 实验动物  16
    1.2 主要仪器及耗材  16
  2.实验方法  16-19
    2.1 动物选择  16-17
    2.2 先天性直肠肛门畸形动物模型的制作方法  17-18
    2.3 病理标本收集  18
    2.4 SHh免疫组织化学染色  18-19
  3.观察项目  19
  4.统计学分析  19-20
结果  20-34
  1.造模及病理检测结果  20-34
    1.1 肛门直肠畸形发生率  20-22
    1.2 病理检测结果  22-34
讨论  34-40
  1、正常肛门直肠的发育过程  34-35
  2、肛门直肠畸形发生的机制  35-36
  3、SHh基因与先天性肛门直肠畸形  36-40
小结  40-41
参考文献  41-44
附录 英文缩略词  44-45
攻读硕士学位期间发表的学术论文及成果  45-46
致谢  46

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