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K-ATP通道调制神经炎性和成年鼠脑神经再生的研究

作　者: 周芳
导　师: 胡刚
学　校: 南京医科大学
专　业: 药理学
关键词: ATP敏感性钾通道神经保护埃他卡林神经退行性疾病小胶质细胞神经炎性神经再生神经干细胞
分类号: R741
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

ATP敏感性钾通道（ATP-sensitive potassium channel，K-ATP通道）是一类耦联细胞代谢和电活动、以细胞内的ATP／ADP水平为门控因素、非电压依赖性的特殊钾离子通道。近年来，包括本实验室在内的研究表明K-ATP通道特别是线粒体K-ATP通道（mitochondrial ATP-sensitive potassium channel，mitoK-ATP通道）不仅是急性缺血缺氧、氧化应激等病理因素损伤时机体的重要内源性保护机制，而且与帕金森病（Parkinson’s disease，PD）的发生、发展密切相关，是探索PD临床治疗学突破和研发理想神经保护剂的新靶标。由于目前缺乏能够透过血脑屏障、对外周循环系统影响较小的K-ATP通道开放剂，针对PD等神经退行性疾病与K-ATP通道的相关性及其神经保护作用的研究大多局限于离体研究。新型K-ATP通道开放剂埃他卡林（Iptakalim，IPT）是我国学者自行设计、合成的脂肪仲胺类小分子化合物，易透过血脑屏障，使得在整体动物模型上研究、评价K-ATP通道开放剂的神经保护作用成为可能。本实验室前期研究显示，IPT在不扩张血管和降低血压的剂量下，即可对急、慢性脑缺血损伤和PD模型鼠具有确切的神经保护作用，提示IPT是富有前景的靶向于K-ATP通道的新型神经保护剂先导化合物。然而，K-ATP通道开放剂发挥神经保护作用的机制尚缺乏深入研究。神经退行性疾病（neurodegenerative diseases）是一类慢性进行性的神经系统疾病，包括PD，阿尔茨海默病（Alzherimer’s disease，AD），亨廷顿舞蹈病（Huntington’s disease，HD），肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）等。虽然这类疾病的病变部位及病因各不相同，但神经细胞退行性变（neurodegeneration）是它们的共同点。研究发现，兴奋性毒性、神经炎性（neuroinflammation）、氧化应激、细胞凋亡及线粒体功能障碍等机制在神经细胞死亡中发挥重要作用，它们之间相互影响，最终导致神经功能失调和细胞死亡。针对神经退行性疾病的发病机制，人们提出了神经保护（neuroprotection）的概念，努力寻求能够延缓神经元死亡或促进神经系统功能恢复的治疗药物。但是，根据上述病理机制而采用的NMDA受体拮抗剂、抗氧化剂、凋亡抑制剂等大多在实验研究中显现显著神经保护作用的药物由于其作用靶点单一，对于发病机制复杂的神经退行性疾病并无理想的临床疗效。因此，近年提出针对神经退行性疾病的复杂病理机制实施多靶点保护性治疗的学术观点，今后研发的药物应着力于关键靶点的发现，这些关键靶点应该能够针对上述的各种病理机制、阻断神经退行性疾病进程中级联反应的多个关键环节。基于神经损伤机制与时程变化的研究，目前认为损伤早期抗兴奋性毒性、抗神经炎性和损伤后期促组织修复、再生是有效的神经保护策略。包括本实验室在内的研究发现，K-ATP通道开放剂具有抗兴奋性神经毒性和抗凋亡的作用。作为富有前景的神经保护治疗的内源性靶点，K-ATP通道是否对神经炎性和损伤后期的组织修复、再生也具有调节作用?这将是本文工作的重点研究内容。小胶质细胞活化介导的神经炎性反应是PD等神经退行性疾病发生的早期机制之一，其活化后释放大量的细胞毒性物质，如致炎因子（TNF-α、PGE₂、IL-1β、NO）、活性氧族（ROS）等是导致多巴胺（Dopamine，DA）能神经元变性、死亡的重要因素。因此，调制脑内小胶质细胞活化及其介导的神经炎性反应是神经保护的重要新策略，发展靶向于小胶质细胞的抗神经炎性保护剂，为PD临床治疗学的突破展现了良好的前景。另一方面，神经再生（neurogenesis）是成年中枢神经系统自我修复的代偿机制，一旦神经元的缺失和新神经元形成之间的平衡紊乱，神经再生对神经元缺失的代偿功能丧失，导致中枢神经系统功能障碍。因此，探索调节成体神经再生的内源性靶点将为神经退行性疾病如PD和AD的治疗带来希望，为发展靶向于调制神经再生的药物和干细胞移植用于PD等神经退行性疾病的神经元修复和功能重建积累学术基础。然而，目前学术界尚未见小胶质细胞和神经干细胞表达K-ATP通道及功能的报道。除了直接保护神经元外，K-ATP通道开放剂是否调节小胶质细胞活化及其介导的神经炎性反应?K-ATP通道是否参与调节神经再生而发挥神经保护作用?这些科学问题的阐明，不仅开拓了神经保护的新领域，也将为发展理想的神经保护剂提供新的靶标。因此，本文工作第一部分首先应用Rotenone建立PD大鼠模型，系统研究了K-ATP通道开放剂的神经保护作用，及其与抗神经炎性、促神经再生的相关性；第二部分在鉴定原代培养的大鼠小胶质细胞上K-ATP通道表达及其亚基构成的基础上，研究K-ATP通道对Rotenone诱导的小胶质细胞活化的调节及其机制；第三部分从整体、细胞和分子水平研究了K-ATP通道开放剂促神经再生的作用及机制。第一部分K-ATP通道开放剂对Rotenone致PD模型大鼠的神经保护作用及其机制目的：研究、阐明K-ATP通道开放剂对Rotenone制备的PD模型大鼠的神经保护作用及其机制。方法：连续4周给予SD大鼠Rotenone(2.5mg·kg^-1·day^-1，s．c．)建立PD大鼠模型。IPT(1.5或3.0mg·kg^-1·day^-1)或mitoK-ATP通道开放剂Diazoxide(1.5或3.0mg·kg^-1·day^-1)在Rotenone给药前三天开始灌胃，自第四天起，于每天IPT或Diazoxide灌胃后1h背部皮下注射Rotenone(2.5mg·kg^-1·day^-1)，连续给药4周，统计各组大鼠死亡率并进行行为学检测；免疫组织化学法检测脑黑质区DA能神经元的存活（TH染色），同时检测黑质部位小胶质细胞的活化（OX-42和ED1染色）；RT-PCR法检测脑纹状体和黑质中TNF-α和COX-2 mRNA水平的变化，ELISA法检测黑质和外周血中TNF-α蛋白水平的变化；应用BrdU标记及免疫组织化学法检测海马神经再生的变化。结果：1) Rotenone组大鼠死亡率为40％，肌僵直实验中大鼠前爪移动潜伏期显著延长，滚轴实验中大鼠爬行时间显著缩短，提示大鼠出现明显的运动障碍；IPT(1.5或3.0mg·kg^-1·day^-1)和Diazoxide(1.5或3.0mg·kg^-1·day^-1)均可显著降低大鼠死亡率（分别为19％、13％，19％和19％），显著缓解Roteone引起的肌僵直和运动障碍。2)Rotenone显著诱导大鼠黑质DA能神经元变性死亡（TH阳性细胞数下降至对照组的36.9％），并伴有小胶质细胞活化的显著增强，TNF-α和COX-2 mRNA表达水平增加及外周血中TNF-α水平的增加；IPT(1.5或3.0mg·kg^-1·day^-1)和Diazoxide(1.5或3.0mg·kg^-1·day^-1)均可显著对抗Rotenone导致的神经毒性，促进DA能神经元存活（TH阳性细胞数恢复至对照组的93％、89.2％、92.9％，和94.2％），并抑制Rotenone诱导的小胶质细胞活化、TNF-α和COX-2 mRNA表达增加及外周血中TNF-α的增加。3) Rotenone显著抑制大鼠海马DG区BrdU标记的新生细胞数量；IPT(3.0mg·kg^-1·day^-1)和Diazoxide(3.0mg·kg^-1·day^-1)均可逆转Rotenone抑制神经再生的作用，促进新生细胞数量恢复至正常水平。结论：K-ATP通道开放剂能够显著缓解Rotenone诱导的大鼠帕金森样症状，促进黑质DA能神经元存活，其神经保护作用机制与抑制小胶质细胞活化介导的神经炎性反应和促进神经再生相关。第二部分小胶质细胞表达K-ATP通道的发现及其对小胶质细胞活化的调节目的：在鉴证原代培养的大鼠小胶质细胞表达K-ATP通道的基础上，研究、阐明K-ATP通道调制Rotenone诱导的小胶质细胞活化的作用及其机制。方法：应用RT-PCR、Western blotting、免疫双染法检测原代培养的大鼠小胶质细胞上K-ATP通道的表达及其亚基构成；显微镜下观察小胶质细胞活化的形态学变化；免疫荧光细胞化学法检测小胶质细胞活化marker ED1的表达变化；ELISA法检测细胞培养液中TNF-α的含量；放射免疫测定法（RIA）检测PGE₂的含量；应用荧光探针DCFH-DA检测小胶质细胞内ROS的含量；应用荧光探针JC-1检测小胶质细胞线粒体膜电位；Western blotting检测小胶质细胞内p38和JNK磷酸化水平。结果：1)原代培养的大鼠小胶质细胞表达K-ATP通道，其亚基组成为不同于神经元的Kir6.1和SUR2.2)10μM IPT或100μM Diazoxide预处理均能显著抑制Rotenone（10nM）诱导的小胶质细胞形态学的改变、ED1表达的上调及TNF-α、PGE₂、ROS的生成增加；并且该作用被mitoK-ATP通道阻断剂5-HD（250μM）取消。3) 10μM IPT或100μM Diazoxide预处理均能逆转Rotenone（10nM）导致的小胶质细胞线粒体膜电位的下降及p38、JNK磷酸化水平的增加；该作用可被5-HD所阻断。结论：原代培养的大鼠小胶质细胞表达K-ATP通道，其亚基组成为Kir6.1和SUR2；小胶质细胞上mitoK-ATP通道的开放能抑制Rotenone诱导的小胶质细胞活化及致炎因子的生成，其作用机制与稳定线粒体膜电位及抑制p38／JNK MAPK信号通路激活有关。第三部分K-ATP通道开放剂对成年C57Bl／6J小鼠脑神经再生的调节目的：研究、阐明K-ATP通道开放剂调节神经再生的作用及其机制。方法：应用RT-PCR、Western blotting法检测原代培养的成年C5781／6J小鼠神经干细胞上K-ATP通道的表达；[³H]-脱氧胸腺嘧啶摄取实验检测IPT对原代培养的成年鼠神经干细胞增殖的影响；连续4周给予正常成年C57Bl／6J小鼠IPT(10mg·kg^-1·day^-1，i．p．)，应用BrdU标记新生细胞，神经元特异性抗体NeuN、星形胶质细胞抗体GFAP与BrdU免疫荧光双染检测新生细胞的分化；western blotting法检测ERK1／2和CREB的磷酸化水平；应用Kir6.2^-/-小鼠研究Kir6.2基因敲除对IPT促神经再生作用的影响。结果：1)原代培养的C57B1／6J成年小鼠神经干细胞表达Kir6.1亚基组成的K-ATP通道，而不表达Kir6.2亚基。2)与对照组相比，IPT（1、10、100μM）均能显著促进原代培养的成年鼠神经干细胞的增殖。3)连续4周给予IPT(10 mg·kg^-1·day^-1)显著增强正常C57B1／6J小鼠海马区神经再生，但不影响神经干细胞向神经元的分化率。4)连续4周给予IPT(10 mg·kg^-1·day^-1)促进正常C57B1／6J小鼠海马区ERK1／2和CREB的磷酸化。5)Kir6.2基因敲除不影响IPT促神经再生的作用。结论：原代培养的C57B1／6J成年小鼠神经干细胞表达由Kir6.1亚基组成的K-ATP通道，而不表达Kir6.2亚基。K-ATP通道开放剂IPT通过作用于Kir6.1亚基组成的K-ATP通道促进神经再生，其机制与激活ERK-CREB信号通路相关。综上所述，本文工作的主要创新之处在于：1．揭示K-ATP通道的开放对Rotenone制备PD模型鼠具有显著的神经保护作用，其机制与抑制神经炎性、促进神经再生相关，为PD的治疗提供了新的思路，也为将IPT发展为治疗PD的新型神经保护剂积累了必要的学术与实验基础。2．发现原代培养的大鼠小胶质细胞表达K-ATP通道，其亚基组成为不同于神经元的Kir6.1和SUR2，开放小胶质细胞上的mitoK-ATP通道可抑制小胶质细胞活化及神经炎性反应，其机制与稳定线粒体膜电位及抑制p38／JNK MAPK信号通路激活相关。研究结果为研发靶向于Kir6.1／SUR2的抗神经炎性保护剂提供了新的靶标。3．发现成年鼠神经干细胞表达Kir6.1亚基构成的K-ATP通道而不表达Kir6.2亚基，该通道参与调节神经再生，其机制与活化ERK-CREB信号通路相关。研究结果为发展靶向于调制神经再生的药物和神经干细胞移植用于PD等神经退行性疾病的临床治疗提供了理论依据。

全文目录

英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-14
英文摘要  14-21
前言  21-39
  一、神经保护的基拙与临床研究  21-23
  二、K-ATP通道与神经保护  23-29
  三、抗神经炎性反应是神经保护治疗的新策略  29-34
  四、促神经再生是神经保护治疗的新策略  34-37
  五、本文研究工作的主要内容及意义  37-39
第一部分 K-ATP通道开放剂对Rotenone致PD模型大鼠的神经保护作用及其机制  39-57
  引言  39-40
  材料与方法  40-44
  结果  44-54
  讨论  54-56
  结论  56-57
第二部分小胶质细胞表达K-ATP通道的发现及其对小胶质细胞活化的调节  57-74
  引言  57-58
  材料与方法  58-62
  结果  62-71
  讨论  71-73
  结论  73-74
第三部分 K-ATP通道开放剂对成年C57BI/6J小鼠脑神经再生的调节  74-86
  引言  74-75
  材料与方法  75-78
  结果  78-84
  讨论  84-85
  结论  85-86
结语  86-90
参考文献  90-103
附录  103-104
  在读期间发表的与本论文相关的文章  103-104
综述  104-118
致谢  118-119

K-ATP通道调制神经炎性和成年鼠脑神经再生的研究

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